大麻二酚對應激大鼠肺部損傷的預防保護作用

葉程龍，余偉，莫斯喻，任建輝，趙春鶴，臧林泉

(廣東藥科大學藥學院，廣東 廣州 510006)

應激反應是由各種應激源引起的個體非特異性反應，處于應激狀態下的神經內分泌系統主要依賴于腎素-血管緊張素系統和下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)的激活。有研究報道發現急性應激障礙大鼠腦組織產生過多自由基產生腦損害[1]，動物實驗證明：在較為強烈的急性應激環境下大鼠肺部會出現一定程度的損傷，這可能是源于HPA軸的過度持續激活導致外周激素的分泌紊亂。大麻二酚(cannabidiol，CBD)是提取自植物大麻的一種化學成分，它和四氫大麻酚(THC)是自大麻植物中分離得到含量最高的2種大麻素[2]。CBD和THC在神經系統保護、抗炎抗氧化以及抗腫瘤方面具有很大的藥用價值，所不同的是CBD并沒有THC的致幻成癮作用[3]。研究發現CBD可有效調控神經細胞的凋亡和調控星形膠質細胞的功能障礙降低腦受損功能，對于緩解抑郁和社交焦慮障礙也有一定作用[4]，這表明CBD可能具備一定的抗應激能力，但未見相關文獻報道。本研究旨在探討應激大鼠給藥后血清中CORT及肺損傷相關炎癥因子TNF-α及IL-1β含量變化及CBD對應激大鼠的肺損傷的干預保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑

健康雄性8周齡SD大鼠40只，體質量180～200 g，購自廣東省醫學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK(粵)2013-0002。

CBD購自廣州合誠化學有限公司(批號：HS-180554)；TNF-α、IL-1β、CORT的ELISA檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司(批號：12/2018)；OCT包埋劑購自美國Sakura公司；黏附載玻片購自江蘇世泰實驗器材有限公司；一次性病理刀片購自德國萊卡公司。

1.2 動物模型的建立與分組

將40只雄性SD大鼠隨機分成5組并按預實驗結果設置以下劑量：正常對照組(NS，10 mL/kg)、模型對照組(NS，10 mL/kg)，低、中、高劑量CBD組(CBD，12 mg/kg、36 mg/kg、108 mg/kg)，每組8只。采取灌胃給藥的方式，各組大鼠在造模前3天開始每日早晚2次灌胃給藥，最后一次給藥結束后，除正常對照組外其他組大鼠均采用固定四肢的方式束縛于鼠板，置于20 ℃冷水中進行48 h的水浸束縛應激，中途短暫解綁休息并使其自由飲水。應激結束后對各組大鼠進行麻醉，然后腹主動脈取血，處死后解剖留取肺組織于-80 ℃超低溫冰箱內保存。

1.3 肺臟器系數和肺組織濕/干質量(W/D)比值的測定

解剖前使用電子秤稱量大鼠體質量。解剖后取大鼠完整肺組織，稍微吸干表面血液后于分析天平稱量全肺質量，按臟器系數=臟器質量/體質量×100%公式計算各組大鼠臟器系數。再取大鼠右肺上葉于分析天平稱量濕質量，將其置于60 ℃烘箱內烘烤72 h后取出稱量其干質量，計算濕/干質量比值(wet/dry weight ratio)。

1.4 組織病理學方法檢測肺組織形態學變化

按上述方法稱肺全質量后，取左肺于4%(φ)多聚甲醛內固定24 h后按常規方法制作肺組織病理切片，HE染色后于光學顯微鏡下觀察組織病理學變化。

1.5 ELISA法檢測血清中CORT、TNF-α、IL-1β水平

大鼠麻醉后腹主動脈取血，室溫下自然放置血液凝固30 min，4 ℃冷凍離心20 min(3 000 r/min)。仔細吸取上清，-20 ℃低溫保存備用。

用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定大鼠血清中腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白細胞介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)、皮質酮(Corticosterone，CORT)含量，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠肺臟器系數及肺組織W/D比較

實驗結果表明：模型組肺臟器系數和W/D都明顯高于正常組(P<0.01)。CBD中、高劑量給藥組肺臟器系數和W/D值與模型組相比都顯著降低(P<0.01)，且呈劑量依賴性。見表1。

2.2 各組大鼠肺組織病理形態學比較

由HE染色結果可以看出：正常組大鼠肺組織結構、形態正常；模型組肺組織肺泡壁增厚，肺泡間隙變大，肺泡結構出現坍塌并伴有部分炎性細胞浸潤。與模型組相比，CBD各劑量給藥組肺組織結構的破壞和水腫程度都有減輕，且呈劑量依賴性。各組大鼠肺組織HE染色情況如圖1所示。

2.3 各組大鼠血清中CORT、TNF-α、IL-1β含量比較

ELISA結果表明：模型組大鼠相較于正常組大鼠，血清中CORT、TNF-α及IL-1β濃度顯著升高。與模型組比較，高劑量CBD給藥組血清中CORT含量顯著下降(P<0.01)，中、高劑量CBD給藥組血清中TNF-α及IL-1β含量顯著下降(P<0.05或P<0.01)且下降程度呈劑量依賴性。各組大鼠CORT、TNF-α、IL-1β血清含量詳見表2。

表1各組大鼠臟器系數及W/D

組別劑量/(mg·kg-1) 肺臟器系數/%W/D正常組- 1.395±0.067 4.533±0.339模型組- 1.518±0.053## 6.365±0.413##CBD 低劑量組121.438±0.0906.179±0.402 中劑量組36 1.421±0.051?? 5.860±0.222?? 高劑量組 108 1.397±0.053?? 4.896±0.425??

與正常組比較：##P<0.01； 與模型組比較：**P<0.01。

A．正常組; B.模型組; C.CBD低劑量組; D.CBD中劑量組; E.CBD高劑量組。

與正常組比較：##P<0.01； 與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

應激是動物應對突變的外界狀況而產生的一種情緒心理狀態，也是當生物受到外界情況的變化時生物體對刺激的持續反饋狀態，這些刺激可以是物理性的、軀體的，也可以是社會性的、心理的。處于應激狀態下的神經內分泌系統主要依賴于腎素-血管緊張素系統和下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)的激活，HPA軸主要分泌的促腎上腺皮質激素(ACTH)和CORT的水平變化常常被認為是判斷應激程度的指標[5]。在較為強烈的應激源如劇烈的精神刺激或持續困境的作用下，HPA軸的持續激活會導致血中皮質酮濃度持續處于高水平狀態從而打破原有的負反饋調節系統，這將嚴重影響機體器官組織的正常運作。在本實驗中選擇使用冷水浸泡束縛大鼠的方法意在通過創造一個對大鼠窘迫的生存困境，誘使其持續產生較為強烈的急性應激障礙，以模擬現代人群面對重大突發情況如失獨或災難等產生的心理應激狀態。本研究發現在應激實驗初期大鼠會產生類似過度通氣的情況，在經過一段時間后的持續應激后其肺部會出現一定的肺充血現象和少量出血點，病理學切片檢測發現較長時間的應激會使得大鼠肺臟局部出現較為明顯的病理學變化。

近年來，歐美國家對具有非精神活性成分的大麻提取物CBD的藥理研究和藥物開發應用得到了較大的進展，CBD純品的制劑已經被用于治療多發性硬化癥和兒童發作性癲癇[7]。研究發現CBD有一定的抗炎抗氧化作用，Ribeiro等[8]證實單劑量的CBD對脂多糖誘導的急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征有一定的保護作用。近年來有研究表明大腦中的糖皮質激素和大麻素受體系統被認為是治療壓力相關疾病的關鍵[9]，同時CBD還可有效調控神經細胞的凋亡和調控星形膠質細胞的功能障礙降低腦受損功能，能一定程度緩解社交焦慮障礙和抑郁[10]。目前國內外對CBD的研究大多數集中在癲癇等中樞性疾病，本研究發現CBD可以有效降低應激大鼠外周血中CORT、TNF-α及IL-1β水平，該作用目前未見文獻報道，這提示CBD對壓力應激的調節作用同時體現在中樞和外周兩方面。

本研究結果顯示，模型組大鼠血清中CORT、TNF-α和IL-1β含量都相比正常對照組升高且差異有統計學意義，而CBD高劑量組的血清學指標則相對模型組有顯著性下降，這說明高劑量的CBD對大鼠急性應激有明顯的對抗作用。同時，在給予不同劑量的CBD后組織病理學切片結果顯示CBD高劑量組相比模型組，其肺泡壁無明顯增厚且炎癥細胞浸潤程度明顯降低，這說明CBD對應激大鼠的肺部具有保護作用。

綜上所述，可初步明確CBD對應激大鼠的肺部損傷有一定的改善作用，尤其以高劑量更為顯著，其機制可能是通過抑制了HPA軸的激活導致外周CORT分泌的減少，進一步下調了血清TNF-α和IL-1β的表達，從而減弱肺部炎癥信號間的傳導間接減少氧化應激對肺部的損傷。從上述實驗可推斷CBD可能是急性應激障礙所致肺損傷的潛在治療手段，因此有必要進一步對CBD的外周應激相關靶點進行更深入的分子機制研究。