復方腦肽節苷脂對腦缺血再灌注損傷模型大鼠的保護作用

徐 悅，鄭永強，付蓓蓓

（湖北省十堰市人民醫院·湖北醫藥學院附屬人民醫院神經內科，湖北 十堰 442000）

腦缺血再灌注會導致局部缺血腦組織功能損害，其損害程度與缺血時間長短及殘存血流量有關，短期不完全性缺血引起可逆性損害，而長期完全缺血或嚴重缺血會引起梗死[1-3]。內質網是細胞表面和細胞外蛋白質的合成、加工和轉運的主要場所，當未折疊蛋白聚集及Ca2+平衡紊亂時，將發生內質網應激，進而誘導神經細胞凋亡[4-5]。自噬基因 Beclin1，Parkin，PINK1 是細胞凋亡調節因子[6]。復方腦肽節苷脂具有抗炎、抗氧化、免疫調節、保肝等多種作用，能通過抑制缺血區苯二氮 受體的表達，減少半暗區面積，從而發揮對缺血腦組織的保護作用[7]。本研究中探討了復方腦肽節苷脂對腦缺血再灌注損傷模型大鼠的保護作用及對Beclin1，Parkin和PINK1表達的影響，為腦缺血再灌注損傷的臨床治療提供了理論依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器與試藥

動物：清潔級 SD大鼠 120只，12周齡，體質量（109.76 ± 11.03）g，雌雄兼半，由山東大學醫學院實驗動物中心提供[動物生產許可證號SCXK(魯)20090001]，大鼠自由攝食及飲水，自動控制晝夜循環（12 ／12 h），室溫（22 ±1）℃。每周稱體質量 1 次，每周調換籠位1次，符合《實驗動物管理條例》要求。

儀器：MK3型酶標儀（美國熱電公司）；ABI7500型熒光聚合酶鏈反應（PCR）儀（賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司）。

試藥：復方腦肽節苷脂注射液（吉林步長制藥有限公司，國藥準字 H22026472，規格為每支2 mL）；銀杏葉提取物注射液（金納多，臺灣濟生化學制藥廠股份有限公司，規格為每支 5 mL ∶17.5 mg）；Beclin1，Parkin，PINK1酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒(批號為KIT10154-2，KIT10416-7，KIT10575-1)，均購自南京金益柏生物科技有限公司；Beclin1，Parkin，PINK1一抗、二抗均購自武漢伊艾博科技有限公司；DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；miRNeasy Mini試劑盒購自美國Qiagen公司；水為蒸餾水。

1.2 方法

建模與分組、給藥：將120只SD大鼠隨機分為6組，即假手術組（A組，等體積0.9%氯化鈉注射液），模型組（B組，等體積0.9%氯化鈉注射液），金納多組（C組，50 mg ／kg）與復方腦肽節苷脂低、中、高劑量組（D1，D2，D3，2，4，8 mg ／kg）。B 組、C 組、D1組、D2組、D3組大鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉后，結扎頸外動脈遠端，在頸外動脈上切開1個小口，將1條尼龍線（直徑0.25 mm，尖端涂抹硅膠）插入頸內動脈至20 mm，并結扎，4 h后，將線栓輕輕拉出，以建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型。A組只切開皮膚和分離血管，不進行阻塞血流。術后給予大鼠20萬U青霉素肌肉注射，連續使用3 d。建模成功后各組大鼠腹腔注射相應藥物，每天1次，持續14 d，根據成人劑量公式相應換算，大鼠用藥量為成人的6.24倍，將注射液溶于蒸餾水，以20.0 mL／kg劑量腹腔注射，配制藥液質量濃度為10.0 g／mL。

神經功能缺損評分：分別于給藥7，14 d時，根據Bederson JB評分法[8]進行神經功能缺損評分，包括運動、感覺、反射和平衡能力測試等。

貼紙去除及平衡木行走試驗：給藥14 d時，依據相關文獻[9]方法進行。

Beclin1，Parkin，PINK1 mRNA 水平檢測：給藥 14 d后，處死大鼠，以逆轉錄定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測Beclin1，Parkin，PINK1 mRNA的表達水平。大鼠腦組織樣品中提取總RNA，合成cDNA，以 β-actin引物為內參。PCR條件：95℃持續 10 min，40個循環，持續 15 s，溫度 60 ℃ 。使用 SDS 2.0.1 軟件（Applied Biosystems）計算循環閾值（Ct）值。

Beclin1，Parkin，PINK1蛋白水平檢測：稱取大鼠缺血腦組織，制成勻漿，收集上清液，以ELISA法檢測Beclin1，Parkin，PINK1 蛋白水平。

Beclin1，Parkin，PINK1蛋白表達水平觀察：制作常規大鼠缺血腦組織石蠟切片，使用常規鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶法進行免疫組化染色，將組織列切片用二甲苯脫蠟，通過梯度乙醇脫水浸入含有0.3%過氧化氫的甲醇中20 min，將切片浸入pH 6的檸檬酸鹽緩沖液中，并在800 W微波爐中加熱10 min進行實現抗原修復。以抗生物素蛋白／生物素結合阻斷內源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，1% 的 Beclin1，Parkin，PINK1抗體工作液(1∶200，V／V)4℃孵育過夜（加鏈霉菌抗生物素蛋白）。3，3′-二氨基聯苯胺四鹽酸鹽（DAB）顯色，蘇木精復染后封片，以乙醇脫水，以二甲苯澄清。隨機選擇10個高倍（400倍）視野，按陽性細胞數量及著色強度進行計分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；同時計數；陽性細胞＞50%為（+++），26% ～50%為（++），6% ～25%為（+），≤5%為（-），（-）及（+）歸為不表達或低表達，即為陰性，（++）及（+++）歸為高表達，即為陽性。

1.3 統計學處理

采用SPSS 23.0統計學軟件分析。計量資料以 X±s表示，行 t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經運動功能評分

結果見表1。與A組比較，B組大鼠神經功能缺損評分顯著升高(P＜0.05)；與 B組比較，C組與 D1組、D2組、D3組大鼠給藥7 d及14 d時神經功能缺損評分顯著降低(P＜0.05)，且與復方腦肽節苷脂給藥劑量呈負相關。

2.2 雙側貼紙去除時間和平衡木過桿時間

結果見表1。與A組比較，B組大鼠雙側貼紙去除時間、平衡木過桿時間均顯著延長(P＜0.05)；與B組比較，C組與D1組、D2組、D3組雙側貼紙去除時間、平衡木過桿時間均顯著縮短(P＜0.05)，且與復方腦肽節苷脂給藥劑量呈負相關。

2.3 Beclin1 mRNA，Parkin mRNA，PINK1 mRNA 表達水平

結果見表1。與A組比較，B組大鼠腦組織Beclin1 mRNA和PINK1 mRNA表達水平均顯著降低，Parkin mRNA表達水平顯著升高；與B組比較，C組與D1組、D2組、D3組大鼠腦組織Beclin1和PINK1 mRNA表達水平均顯著升高，Parkin mRNA水平顯著降低（P＜0.05），且隨著復方腦肽節苷脂給藥劑量的增加，Beclin1和PINK1 mRNA表達水平逐漸升高，Parkin mRNA表達水平逐漸降低。

2.4 Beclin1，Parkin，PINK1 蛋白表達水平

結果見表1和圖1。與A組比較，B組大鼠腦組織Beclin1和PINK1蛋白表達水平均顯著降低，Parkin蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與B組比較，C組與D1組、D2組、D3組大鼠腦組織 Beclin1和 PINK1蛋白表達水平均顯著升高，Parkin蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），且隨著復方腦肽節苷脂給藥劑量的增加，Beclin1和PINK1蛋白表達水平均逐漸升高，Parkin蛋白水平逐漸降低。Beclin1，Parkin，PINK1陽性表達為棕褐色，各組Beclin1，Parkin，PINK1陽性表達情況與各蛋白表達水平相符。

表1 各組大鼠觀察指標比較（X±s，n＝20）

圖1 復方腦肽節苷脂對模型大鼠自噬基因表達的影響(×400)

3 討論

Parkin和PINK1是調節神經細胞凋亡的重要調控因子，PINK1是抑制細胞凋亡蛋白，Parkin是促細胞凋亡蛋白[10-11]。細胞中，當Parkin表達水平較高時，PINK1與Parkin通過磷酸二酯脫氫鍵形成同源二聚體PINK1／Parkin，促進細胞凋亡，PINK1表達水平較高時則通過氫鍵形成異源二聚體PINK1／Parkin，抑制細胞凋亡[12-14]。Beclin1是調節內質網應激效應介導的細胞凋亡的保護主要因素。Beclin1可直接抑制Caspase-3和Caspase-7的活性，來阻斷各種刺激誘導的細胞凋亡過程[15]。

復方腦肽節苷脂能促進缺血腦組織的新陳代謝，參與缺血腦組織神經細胞生長、分化和再生過程，具有抗細胞凋亡作用。復方腦肽節苷脂可能通過降低核因子-κB（NF-κB）活性及調節其表達而起到抗凋亡作用[16]。此外，復方腦肽節苷脂可以增強過氧化物酶-6的表達，從而減少缺氧誘導的內質網應激效應和氧化應激反應，減少神經細胞凋亡，達到保護神經細胞的目的。本研究結果顯示，復方腦肽節苷脂能明顯改善腦缺血再灌注損傷模型大鼠的神經功能、感覺及運動功能，高劑量效果尤為明顯；能促進腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織Beclin1及PINK1表達，抑制Parkin表達，進而抑制神經細胞凋亡。

綜上所述，復方腦肽節苷脂對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用較好，能明顯改善其神經功能、感覺及運動功能，其機制與復方腦肽節苷脂能促進Beclin1 mRNA，PINK1 mRNA及蛋白的表達，抑制Parkin mRNA及蛋白的表達，進而抑制神經細胞凋亡有關。