高效液相色譜法測定腸炎灌腸液中鹽酸小檗堿含量

陳 珂 ，黃 銳 ，蒲清榮 ，任桂林 ，李五生

（1.四川省瀘州市食品藥品檢驗所，四川 瀘州 646000； 2.西南醫科大學附屬中醫醫院，四川 瀘州 646000）

慢性結腸炎為慢性非特異性大腸黏膜炎性腸病[1]，臨床一般采用水楊酸類藥物、皮質激素、免疫抑制劑、甲硝唑保留灌腸法等治療[2-3]，毒副作用多。腸炎灌腸液為西南醫科大學附屬中醫醫院肛腸外科專家、四川省名中醫李五生主任醫師以白頭翁湯為基礎反復優化而成，由白頭翁、黃柏、黃連（酒制）、秦皮等 8味中藥組方[4]，有清熱利濕、涼血解毒功效，對慢性結腸炎療效顯著，且復發率低、不良反應小。該方作為協定處方已使用多年，效果良好，適用于醫療機構制劑的開發。為控制制劑質量，確保臨床療效，本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法測定腸炎灌腸液中鹽酸小檗堿的含量。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀(包括LcSolution色譜工作站、SPD-20A型紫外檢測器、CTO-10AS進樣器)、AUW120D型十萬分之一電子天平(日本Shimadzu公司)；JP全數字超聲波發生器（武漢嘉鵬電子有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸小檗堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110713-201212，供含量測定用）；腸炎灌腸液（西南醫科大學附屬中醫醫院，批號分別為20161019，20161020，20161021）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Kromasil 100-5 C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 -0.1%磷酸溶液（50 ∶50，V／V，每100 mL 加十二烷基磺酸鈉 0.1 g）；流速：1 mL ／min；檢測波長：265 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL[5]。按上述條件進樣測定，理論板數以鹽酸小檗堿峰計應不低于4000。

2.2 溶液制備

對照品溶液：稱取對照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加甲醇溶解，制成鹽酸小檗堿質量濃度為0.268 8 g／L的對照品溶液Ⅰ。精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇溶解，制成質量濃度為3.455 2 g／L的對照品溶液Ⅱ。

圖1 高效液相色譜圖

供試品溶液：精密量取樣品上層澄清液1 mL，置50 mL容量瓶中，加流動相40 mL，超聲(功率250 W，頻率40 kHz)處理30 min，加流動相定容，濾過，取續濾液，即得。

陰性對照品溶液：按處方比例稱取不含黃連、黃柏的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2項下對照品溶液Ⅰ、陰性對照品溶液各適量，按擬訂色譜條件測定。結果陰性對照無干擾，色譜圖見圖1。

線性關系考察：分別精密量取對照品溶液Ⅰ0.25，0.50，1.00，2.00，4.00，8.00 mL，置 10 mL 容量瓶中，分別加甲醇定容，搖勻，制得質量濃度分別為 6.72，13.44，26.88，53.75，107.51，215.02 g／L 的對照品系列溶液，依次量取10 μL注入液相色譜儀，測定。以峰面積（Y）為縱坐標、鹽酸小檗堿質量濃度（X，g／L）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程 Y＝36 655 X+116 638，r2＝0.999 5（n＝6）。結果表明，鹽酸小檗堿質量濃度在 6.72～215.02 g／L范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取對照品溶液Ⅰ適量，連續測定6次。結果峰面積積分值的 RSD為1.33%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：室溫下取供試品（批號為20161019）溶液適量，分別于 0，2，6，8，12，24 h 時進樣，記錄峰面積。結果峰面積積分值的 RSD為 1.01%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為20161019）1 mL，共6份，依法制備供試品溶液，測定。結果鹽酸小檗堿平均含量為 3.120 0 g／L，RSD 為 0.97% （n ＝6），表明本方法重復性良好。

4.隨著國家普及九年義務教育，將教育擺在優先發展的戰略地位，農村優秀學子通過高考“獨木橋”大量留在城市，并在城市生根發芽，致使農村優質生源逐年減少，隨著高考錄取率增加呈逐年上升趨勢，這也就意味著教育的“紅利”也是農村小規模學校的成因之一。

加樣回收試驗：精密量取樣品（批號為20161019）0.5 mL，共 6份，分別精密加入一定量的鹽酸小檗堿對照品溶液Ⅱ0.5 mL，依法制備供試品溶液，各取10 μL進樣測定，計算回收率，結果見表1。

表1 鹽酸小檗堿加樣回收試驗結果(n＝6)

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，進樣，測定含量。結果批號為 20161019，20161020，20161021的樣品中，鹽酸小檗堿含量分別為 3.160，3.210，3.165 g ／L，平均 3.178 g ／L。

3 討論

3.1 考察指標選擇

處方中黃連、黃柏為君藥，小檗堿作為主要指標成分，具有抑菌作用[6-7]，與腸炎灌腸液的臨床作用密切相關，故選擇小檗堿（以鹽酸小檗堿計）的含量作為考察指標。

3.2 流動相選擇

本研究中對不同流動相及流動相的組成比例、色譜條件進行了篩選。考察了流動相乙腈-0.1%磷酸溶液（50 ∶50，V／V）[8]，乙腈 -0.033 mol／L 磷酸二氫鉀溶液（35 ∶65，V／V）[9]，乙腈 -0.1%磷酸溶液（36 ∶64，V／V）、乙腈 -0.05 mol／L 磷酸二氫鉀溶液（50 ∶50，V／V）[10]，結果色譜峰的分離效果均不理想，經多次試驗比較，最終以乙腈 -0.1%磷酸溶液（50∶50，V／V，每 100 mL 加十二烷基磺酸鈉0.1 g）作為流動相時分離效果好，陰性對照無干擾。

3.3 色譜柱選擇

選用了多個型號的色譜柱進行比較，確定采用Kromasil 100-5 C18柱分析主峰柱效比較理想，雜質峰分離度好。鹽酸小檗堿經全波長掃描發現，265 nm波長處紫外吸收強度良好，故本方法檢測波長采用265 nm，主峰為鹽酸小檗堿，分離度及峰形良好，樣品的其他物質不會干擾測定。

3.4 提取方法選擇

供試品溶液提取方法的研究中比較了以甲醇[11]、甲醇 - 鹽酸[12]、乙腈 -0.1% 磷酸溶液（50 ∶50，V／V）[13]為溶劑進行超聲提取的效果，結果以流動相乙腈-0.1% 磷酸溶液（50 ∶50，V／V）為溶劑時超聲提取效果最好，最終采用該流動相作為提取溶劑。

3.5 方法評價

本研究中建立的方法操作簡便，精密度高，重復性和穩定性好，可用于腸炎灌腸液的質量控制。參考文獻：

[1]葛曼青，李五生.潰瘍性結腸炎臨床治療新進展[J].實用中西醫結合臨床，2014，14（11）：92-94.

[3]李 茜.左氧氟沙星聯合甲硝唑和山莨菪堿治療慢性腸炎的臨床觀察[J].甘肅醫藥，2013，32（12）：892-893.

[4]余騰江，陳衛東，李五生，等.白頭翁湯聯合康復新液灌腸治療濕熱型潰瘍性結腸炎43例臨床觀察[J].云南中醫中藥雜志，2017，38（6）：52-53.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（四部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：374-376.

[6]李彩虹，周克元.黃連活性成分的作用及機制研究進展[J].時珍國醫國藥，2010，21（2）：466-468.

[7]陳陽峰，鐘曉紅.黃柏的藥理作用及其活性成分提取[J].作物研究，2015，29（5）：564-568.

[8]陳 良.黃金膏中鹽酸小檗堿的定性鑒別與含量測定[J].中國藥房，2015，26（30）：4262-4263.

[9]李茂森.復方黃連素片中鹽酸小檗堿含量測定方法改進[J].中國藥業，2013，22（14）：68-69.

[10]劉 佳，陸雪萍.HPLC測定止瀉保童顆粒中鹽酸小檗堿的含量[J].云南中醫學院學報，2016，39（2）：37-39.

[11]李 靜，錢 江.高效液相色譜法同時測定復方黃連素片中芍藥苷和鹽酸小檗堿含量[J].中國藥業，2016，25（7）：61-63.

[12]彭晶玲，李芳平.高效液相色譜法測定糖腎康丸中鹽酸小檗堿含量[J].亞太傳統醫藥，2016，12（7）：29-31.

[13]梁鳳娟.高效液相色譜法測定尿酸膠囊中鹽酸小檗堿的含量[J].臨床和實驗醫學雜志，2007，6（8）：32-33.