土壤中砷形態(tài)提取和分析的條件改進

安禮航，陳 陽，陳志良，劉浩輝，劉敏超，張建強

(1.五邑大學(xué) 生物科技與大健康學(xué)院，廣東 江門 529020；2.環(huán)境保護部華南環(huán)境科學(xué)研究所，廣東 廣州 510655；3.廣東省農(nóng)田重金屬污染土壤治理與修復(fù)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510655)

1 引言

砷(As)是世界范圍內(nèi)農(nóng)田重金屬污染的主要元素之一，尤其在中國、孟加拉國、美國等地[1～3]。不同形態(tài)的砷的毒性有很大的差異，一般來說，無機砷毒性大于有機砷，三價砷毒性是五價砷的60倍[4]。準(zhǔn)確地分析土壤和沉積物中各形態(tài)砷的含量是評價土壤中砷元素的生物毒性及危害程度的必要條件。

此外，據(jù)報道超聲波提取優(yōu)于離心提取和振蕩提取[15]，但白云飛等[16]使用超聲提取獲得的提取率最高只有49.46%。張靜[17]發(fā)現(xiàn)使用100 ℃水浴提取其提取率可達79%，同時超聲萃取只有51%。這說明水浴比超聲的提取效率更高，然而許多研究提取率普遍未超過80%，因此提取方法有待進一步改進與優(yōu)化。

綜上所述，本研究擬改進原有的砷提取方法，采用不同配比的磷酸混合鹽酸作為砷提取溶劑，發(fā)揮彼此的優(yōu)勢和互補性，同時比較了提取劑在不同濃度條件下以及不同的輔助提取手段下的提取效率。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

AFS-52型原子熒光光譜儀(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；TGL-15B型離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；HNY-1102C型水浴恒溫振蕩器(上海百典儀器設(shè)備有限公司)；MIX30S型渦旋混合儀(廣州圍谷潤儀器有限公司)；Milli-Q型超純水儀(廣州東銳科技有限公司)。

三價砷標(biāo)準(zhǔn)溶液：取砷(As3+)標(biāo)準(zhǔn)溶液(廣州博納儀器有限公司)一定量，用(1+9)鹽酸溶液準(zhǔn)確稀釋成含砷(As)1.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。吸取含砷(As)1.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液2.50 mL于25 mL比色管中，加5 mL(1+1)鹽酸溶液搖勻，加6 mL硫脈一抗壞血酸溶液，加水至刻度，充分搖勻，即為含砷(As)100 μg/ L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

五價砷標(biāo)準(zhǔn)溶液：在5.0 mL As (Ⅲ)標(biāo)液(1000 mg/L)中加入5.0 mL 22% H2O2，然后定容至100 mL，2 h后，即為50 mg/L As(V)的標(biāo)液，其余不同含量As(V)的標(biāo)準(zhǔn)配制方法與此類似。

硫脲-抗壞血酸溶液：稱取12.5 g硫脲、12.5 g抗壞血酸溶解定容至250 mL，用時現(xiàn)配。

2.2 土壤樣品

實驗所用的土壤標(biāo)準(zhǔn)樣品來自中國地質(zhì)科學(xué)院地球物理化學(xué)勘察研究所認(rèn)證的泛濫平原沉積物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，有淮河底泥(GSS-32)，黃河底泥(GSS-33)和黑龍江底泥(GSS-35)，樣品具有良好的均一性和粒度分布。

2.3 實驗方法

準(zhǔn)確稱取0.20 g樣品，放人15 mL離心管中，加入適量的提取劑，渦旋混勻后按照正交設(shè)計方案在規(guī)定的時間內(nèi)進行提取，然后在6000 r/min下離心分離20 min，取上層清液過0.25 m濾膜后用一定的量的鹽酸酸化，加入一定量的硫脲-抗壞血酸溶液還原，混勻定容，1 h后用原子熒光測定(總砷)。所有樣品均設(shè)置三個平行。

As(Ⅲ)的測定：取上述提取液3 mL于分液漏斗中，加入20 mL 10 mol/L的HCl，再加3 mL濃HCl，保證酸的濃度達到9 mol/L以上以便完全萃取As(Ⅲ)[18]。使用氯仿萃取As(Ⅲ)，共萃取4次，每次加入3 mL，保留有機相。再用水將As(Ⅲ)從有機相中反萃取出來，反萃取2次，每次加5 mL水，保留水相，定容測定。同時做試劑空白。

As(V)的測定：用總砷含量差減法得到As(V)含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 儀器工作條件的選擇

經(jīng)多次試驗，選出峰形良好且無干擾的儀器最佳工作條件為，通道燈電流：主燈40 mA，輔燈40 mA；負(fù)高壓280 V；載氣流量300 mL/min；屏蔽氣流量：900 mL/min；原子化器高度8 mm；原子化器溫度200 ℃。

3.2 提取劑與提取時間的選擇

本實驗以磷酸混合鹽酸為提取劑，對土壤中不同形態(tài)的砷進行提取。采用正交實驗設(shè)計的方法，在減少實驗量的同時能夠得出影響砷形態(tài)提取的主要因素，獲得最佳的提取條件。采用L16(45)正交水平表進行實驗，以提取所得的總砷含量為監(jiān)控指標(biāo)，考查提取劑濃度(1.5，3，5，8 mol/L)、提取劑比例(磷酸和鹽酸的比例分別為1∶1，2∶1，1∶4，4∶1)、提取時間(10，30，60，90 min)3種因素對提取結(jié)果的影響。稱取0.20 g土于15 mL離心管中，加提取劑8 mL，按2.2節(jié)實驗方法和表1 中設(shè)計的實驗方案進行提取和測定，提取結(jié)果見表1，利用極差分析進行主要影響因素和最佳提取條件的確定，結(jié)果見表2和圖1。

表1 提取劑與提取時間的正交實驗結(jié)果

表2 正交實驗極差分析

圖1 萃取劑和萃取時間的效應(yīng)曲線

由表2和圖1正交實驗極差分析結(jié)果可知：RA>RB>RC，即影響提取效果的因素順序為：提取劑濃度>提取劑比例>提取時間。極差結(jié)果表明，磷酸與鹽酸的混合濃度是影響提取效果的主要因素，當(dāng)總濃度從1.5 mol/L提高到8 mol/L時，提取率大幅下降。實驗過程中發(fā)現(xiàn)當(dāng)提取劑總濃度過高時(≥5 mol/L)會產(chǎn)生較大的試劑空白值，研究表明[19]，磷酸在較高濃度時其氧化性隨之增強，導(dǎo)致空白值也隨之增大，且較難控制提取過程中砷形態(tài)不發(fā)生轉(zhuǎn)化。因此在不影響提取率的條件下，提取劑總濃度不宜過高。其次是提取劑的比例，隨著磷酸組分的比例增大，提取率顯著增加，當(dāng)比例為4∶1時提取率最高，說明磷酸比鹽酸有更好的提取效率，這與前人的研究結(jié)果有所不同；延長提取時間，提取率經(jīng)歷先增加后降低的趨勢，提取時間為60 min時提取率最高。

綜合以上結(jié)果表明，最佳的提取劑的比例為磷酸與鹽酸4∶1，總濃度為1.5 mol/L，提取時間為60 min。經(jīng)試驗，在該條件下，提取率可達57.98%。

3.3 提取條件與提取次數(shù)的選擇

在上述最佳提取劑濃度、比例和時間下進一步篩選提取條件與提取次數(shù)。采用L9(34)正交水平表進行實驗，以提取所得的總砷含量為監(jiān)控指標(biāo)，考查輔助提取手段(渦旋震蕩，超聲，98 ℃水浴)，提取次數(shù)(1、2、3次)，提取劑用量(6、8、12 mL)3種因素對提取結(jié)果的影響。按2.2節(jié)實驗方法和表3中設(shè)計的實驗方案進行提取和測定，提取結(jié)果見表3，利用極差分析進行主要影響因素和最佳提取條件的確定，結(jié)果見表4和圖2。

表3 提取條件與提取次數(shù)的正交實驗結(jié)果

表4 正交實驗極差分析

由正交實驗極差分析結(jié)果可知：RA>RB>RC，即影響提取效果的因素順序為：提取方式>提取次數(shù)>試劑量。極差結(jié)果表明，提取方式是影響提取率的主要因素，使用水浴方式獲得的提取率遠(yuǎn)高于超聲提取，效率最低的是渦旋震蕩。前人雖強調(diào)了超聲提取的優(yōu)勢[20，21]，然而在本實驗中證實加熱確實比超聲提供更大的能量以滿足砷從土壤礦物晶格中釋放，這與Huber[22]等人的研究結(jié)論相同；增加提取次數(shù)，提取率大幅提高，從58.4%提升至82.0%；提取劑用量對提取率影響甚微，增加試劑量，提取率反而略有減小。

綜合以上結(jié)果表明，改進的最佳提取條件為，使用6 mL 1.5 mol/L的磷酸+鹽酸提取劑(比例為4∶1)，用98 ℃水浴提取3次，每次60 min。經(jīng)試驗，在該條件下，提取率可達91.34%。

圖2 提取條件和提取時間的效應(yīng)曲線

3.4 加標(biāo)回收實驗

采用改進的實驗條件對土壤標(biāo)準(zhǔn)樣品GSS-32中進行加標(biāo)回收實驗，測定結(jié)果見表5。

表5 土壤中不同形態(tài)砷的加標(biāo)回收率

實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)As(Ⅲ)回收率僅為25.80%，而As(V)回收率為114.44%，說明在提取過程中由于基質(zhì)的影響As(III)和As(V)之間發(fā)生了轉(zhuǎn)化，As(Ⅲ)全部氧化成了As(V)，這樣的結(jié)果并不能真實的反映土壤中原有砷的各形態(tài)含量。為提高三價砷的回收率，參考前人的研究基礎(chǔ)[23,24]，在加入提取劑同時加入一定量的預(yù)還原劑(0.1，0.15，0.2 mol/L的抗壞血酸)，再一次做加標(biāo)回收實驗予以分析。

實驗結(jié)果顯示，加入預(yù)還原劑后As(Ⅲ)的回收率得以提高。隨著預(yù)還原劑的用量增大，As(Ⅲ)的回收率增大而As(V)的回收率減小，用量過大，則導(dǎo)致As(V)向As(Ⅲ)轉(zhuǎn)化，因此最佳的抗壞血酸用量是0.15 mol/L。數(shù)據(jù)表明，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中As(V)占總砷含量的97.60%(表6)。

3.5 方法的精密度

稱取土壤標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GSS-33和GSS-35各0.2000 g按照最優(yōu)實驗方法進行形態(tài)分析，共進行6組實驗，結(jié)果見表7。

表6 加入預(yù)還原劑后土壤中不同形態(tài)砷的加標(biāo)回收率

表7 方法精密度結(jié)果

實驗結(jié)果表明，使用該法獲得的As(Ⅲ)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.60～2.18%，As(V)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.70～0.85%，精密度良好，浸取方法穩(wěn)定可靠。從結(jié)果還可以看出，GSS-33標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中As(V)為總砷的95.9%，GSS-35標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中As(V)為總砷的98.0%。

3.6 實際樣品分析

以采自廣東汕頭蓮花山鎢礦區(qū)周圍5個不同地點的土壤為樣品，采用最優(yōu)實驗方法進行砷形態(tài)分析。

表8 實際樣品砷形態(tài)分析

測量結(jié)果表明(表8)，5種不同采樣點的土壤中蔬菜地砷含量最高，但所有采樣點的砷含量均未超過國家頒布的《土壤環(huán)境質(zhì)量 農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險管控標(biāo)準(zhǔn)(試行)》(GB 15618-2018)，且大部分砷以毒性較低的As(V)形態(tài)存在。然而，②號蔬菜地和④號水稻土比全國平均土壤含砷量9.2 μg / g[25]高出2.72和1.68倍，對人類健康具有潛在的危害。

4 結(jié)論

采用正交實驗設(shè)計的方法，對以前分析砷形態(tài)的條件進行改進優(yōu)化。改進后，使用1.5 mol/L的磷酸混合鹽酸(4∶1)和0.15 mol/L的抗壞血酸對0.2000 g土壤經(jīng)98 ℃水浴萃取3次，每次1 h，可獲得最高的浸取率(91.34%)。在此條件下，經(jīng)加標(biāo)回收驗證，As(Ⅲ)和As(V)獲得較高的回收率且在誤差允許范圍(n=6，RSD，0.695～2.176%)，精密度良好，該方法是一種提取土壤中砷形態(tài)的簡單高效方法。