不同骨量狀態下初診2型糖尿病患者外周血中PPAR-γmRNA表達水平及意義

王信 樊思桐 肖雪 陽琰 李琪 王哲 羅麗婭 朱玉玉

遵義醫科大學附屬醫院，貴州 遵義 563000

糖尿病(diabetes mellitus，DM)常伴有多種并發癥，其中糖尿病合并骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是糖尿病在骨骼系統中最嚴重的并發癥[1]。外周血單核細胞過氧化物酶體增殖物激活受體γ (peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPARγ)是OP的遺傳易感基因之一[2]。PPARγ是細胞核受體超家族的一員，被激活后可增加胰島素敏感性、促進脂肪細胞分化，在胰島素抵抗、糖尿病、動脈粥樣硬化等代謝性疾病的發生、發展及治療中扮演重要角色[3]。PPAR-γ mRNA的表達可抑制前成骨細胞向成骨細胞分化及成熟[4]。骨保護素(osteoprotegerin，OPG)的主要作用是影響骨代謝，抑制破骨細胞分化、活化成熟及促進其凋亡[5]。維生素D (vitamin D，Vit D)與糖、骨代謝均有密切聯系，其主要功能是維持正常的血鈣磷水平，促進正常骨骼礦化[6]。25(OH)D是維生素D的活性代謝產物之一，為評估維生素D常用觀察指標[7]。不同骨量狀態下2型糖尿病患者外周血中PPAR-γ mRNA表達與血清中25(OH)D、OPG的關系如何，目前國內外未見相關研究報道。因此，本研究擬通過比較健康對照者與T2DM合并不同骨量患者外周血中PPAR-γ mRNA表達水平，旨在探討25(OH)D、 PPAR-γ mRNA調控糖、脂代謝及骨量的可能機制，可能為臨床早期聯合防治糖尿病、骨質疏松提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2017年2月至2018年1月于我院骨科和內分泌科住院的新確診2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者135例(絕經1年以上的女性及年齡≥60歲的男性)，根據骨密度分為三組：T2DM骨量正常組(A組，45例)、T2DM骨量減少組(B組，45例)、T2DM骨質疏松組(C組，45例)，收集同期我院體檢中心年齡、性別相匹配的健康體檢者作為正常對照組(NC組，45例)。健康體檢者均骨密度正常且經口服葡萄糖耐量試驗證實糖耐量正常。T2DM患者均符合1999年WHO糖尿病診斷標準。取得所有受試者的知情同意并通過倫理委員會批準。納入標準：①絕經1年以上女性及年齡≥60歲的男性，符合初診T2DM患者的標準；②無嚴重器質性疾病及糖尿病急、慢性并發癥，肝腎功正常；③正常對照組無糖尿病及骨質疏松等家族遺傳病史；④無煙酒史。排除標準：①既往患有嚴重的心、肝、腎等臟器疾病及其他內分泌疾病者；②近一個月內使用過影響糖、脂、骨代謝的藥物；③受檢前2周有明確感染史；④患有類風濕性關節炎、甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺、性腺、骨腫瘤、垂體等影響骨代謝疾病及骨折者；⑤近半年內曾使用影響骨代謝的藥物(性激素、雙膦酸鹽、糖皮質激素、大劑量鈣劑等)，曾服用或注射過維生素D制劑的患者；⑥有吸煙史或長期大量飲酒史。

骨質疏松癥的診斷標準，參照2017中華醫學會骨質疏松和骨礦鹽疾病分會的原發性骨質疏松癥診療指南診斷標準[8]。根據 DXA 測量結果，骨密度值低于同性別、同種族健康成人的骨峰值 1 個標準差及以內屬正常；降低1～2.5個標準差為骨量低下 (或低骨量)；降低等于和超過2.5個標準差為骨質疏松；骨密度降低程度符合骨質疏松診斷標準，同時伴有一處或多處脆性骨折為嚴重骨質疏松。骨密度通常用T值(T-Score)表示，T值=(實測值-同種族同性別正值常青年人峰值骨密度)/同種族同性別正常青年人峰值骨密度的標準差。基于DXA 測量的中軸骨(腰椎1～4、股骨頸或全髖) 骨密度或橈骨遠端 1/3骨密度對骨質疏松癥的診斷標準是T值≤-2.5。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料的收集：記錄各組受試人員年齡、性別，所有研究對象由專人測量身高、體重、臀圍、腰圍，計算體質量指數(body mass index，BMI)=體重(kg)/身高2(m2)，均錄入數據庫。

1.2.2 一般血生化及糖代謝指標的檢測：研究對象試驗前禁食12 h，禁飲8 h，抽取空腹靜脈血，靜置1 h后，3 000 r/min離心10 min分離血清，標記后-80 ℃低溫冰箱保存。real time PCR檢測PPAR-γ mRNA的表達。采用電化學發光法(德國羅氏診斷配套試劑)測定空腹胰島素(fasting plasma insulin，FINS)、β-膠原降解產物(beta collagenous degradation products，β-CTX)、I-型膠原氨基端延長肽(type I-collagen amino end lengthening peptide，PINP)、25(OH)D；Olympus(AU2700)全自動分析儀檢測血脂；己糖激酶法(貝克曼庫特實驗系統有限公司)測定FPG；高壓液相色譜法測定HbA1c(美國伯樂D-10配套試劑)，計算穩態模型胰島素抵抗指數(HOMA-IR)=FPG×FINS/22.5。

1.2.3 骨密度測定：采用法國MEDILINK公司生產的 Medix 90 DMS測定腰椎(L1～4) 正位、左右股骨近端包括股骨頸(neck)、大轉子(trochiter) 及 Ward三角區的骨密度(bone mineral density，BMD)，單位以g/cm2表示。

表1 各基因引物序列(熒光定量PCR測定)Table 1 Specific primers used for Real-time PCR

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 各組一般資料及臨床生化指標的比較

各組間的年齡、病程、性別、BMI、Ward 三角區及全髖骨密度水平相比較，差異無統計學意義(P>0.05)；A組與B組比較，25(OH)D、PINP、HDL-C水平明顯升高，而OPG、β-CTX、HbA1c、HOMA-IR明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，FPG、LDL-C、TC、TG、FINS組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)；A組與C組比較，25(OH)D、PINP、HDL-C水平明顯升高，而OPG、β-CTX、HbA1c、HOMA-IR明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，而FPG、LDL-C、TC、TG、FINS組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)；A組與NC組比較，OPG、FPG、HbA1c、HOMA-IR、LDL-C、TG、TC、β-CTX、FINS水平明顯升高，而25(OH)D、HDL-C、PINP明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；B組與C組比較，25(OH)D、PINP、HDL-C水平明顯升高，而OPG、β-CTX、HbA1c、HOMA-IR明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，而FPG、LDL-C、TC、TG、FINS組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)；B組與NC組比較，OPG、FPG、HbA1c、HOMA-IR、LDL-C、TG、TC、β-CTX、FINS水平明顯升高，而25(OH)D、HDL-C、PINP明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；C組與NC組比較，OPG、FPG、HbA1c、HOMA-IR、LDL-C、TG、TC、β-CTX、FINS水平明顯升高，而25(OH)D、HDL-C、PINP明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖1、圖2。

表2 各組一般資料及臨床生化指標的比較Table 2 Comparison of general characteristics and biochemical indicators among the four groups

組別FIns(μIU/mL)NC9.16±1.73A11.41±2.25*B11.36±2.22*C11.35±2.19*

注： 與NC組相比,*P<0.05；與A組相比，#P<0.05；與B組相比，ΔP<0.05。

圖1 四組受試者血清25(OH)D水平的比較Fig.1 Comparison of serum levels of 25 (OH) D among the four groups

圖2 四組受試者血清OPG水平的比較Fig.2 Comparison of serum OPG levels in the four groups of subjects

2.2 Real time PCR 檢測PPAR-γ mRNA 的表達

A組與B組比較，外周血中PPAR-γ mRNA表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；A組與C組比較，外周血中PPAR-γ mRNA表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；A組與NC組比較，外周血中PPAR-γ mRNA表達明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；B組與C組比較，外周血中PPAR-γ mRNA表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；B組與NC組比較，外周血中PPAR-γ mRNA表達明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；C組與NC組比較，外周血中PPAR-γ mRNA表達明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3、圖3。

表3 各組中PPAR-γmRNA 的表達Table 3 The expression of PPAR-γ mRNA

注： 與NC組相比,*P<0.05;與A組相比,#P<0.05;與B組相比,ΔP<0.05。

圖3 四組受試者外周血中PPAR-γmRNA表達水平的比較Fig.3 Comparison of expression levels of PPAR-γ mRNA in peripheral blood of the four groups of subjects

2.3 各組間骨密度比較

A組與B組比較，L1-4腰椎骨密度、左側股骨頸骨密度明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，Ward 三角區及全髖骨密度差異無統計學意義(P>0.05)；A組與C組比較，L1～4腰椎骨密度、左側股骨頸骨密度明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，Ward三角區及全髖骨密度差異無統計學意義(P>0.05)；A組與NC組比較，L1-4腰椎骨密度、左側股骨頸骨密度明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，Ward 三角區及全髖骨密度差異無統計學意義(P>0.05)；B組與C組比較，L1-4腰椎骨密度、左側股骨頸骨密度明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，Ward三角區及全髖骨密度差異無統計學意義(P>0.05)；B組與NC組比較，L1-4腰椎骨密度、左側股骨頸骨密度明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，Ward三角區及全髖骨密度差異無統計學意義(P>0.05)；C組與NC組比較，L1-4腰椎骨密度、左側股骨頸骨密度明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，Ward三角區及全髖骨密度差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組間骨密度比較(g/cm2)

Table 4 Comparison of bone mineral density between groups(g/cm2)

組別L1～4腰椎左側股骨頸Ward三角區全髖NC1.30±0.181.01±0.110.70±0.140.74±0.12A1.14±0.14*0.93±0.10*0.63±0.12*0.79±0.21*B0.87±0.09*#0.77±0.09*#0.69±0.08*0.77±0.17*C0.66±0.05*#△0.52±0.07*#△0.65±0.09*0.78±0.20*

注： 與NC組相比,*P<0.05;與A組相比,#P<0.05;與B組相比,ΔP<0.05。

2.4 Pearson相關分析結果

外周血中PPAR-γ mRNA水平與年齡、FPG、TC、TG、LDL-C、FIns的相關性無統計學意義(P>0.05)；與25(OH)D、PINP、HDL-C呈負相關(相關系數r分別為-0.536、-0.366、-0.492，P<0.05)，見表2；與β-CTX、HbAlc、HOMA-IR、OPG表達呈正相關(相關系數r分別為0.392、0.482、0.501、0.428，P<0.05)，見表5。

表5 外周血PPAR-γ mRNA水平與臨床生化指標的相關性分析(r)

Table 5 Correlative analysis of peripheral blood PPAR-γ mRNA level and clinical biochemical indexes (r)

項目PPAR-γ mRNArP值25(OH)D-0.5360.041PINP-0.3660.025HDL-C-0.4920.049OPG0.4280.026β-CTX0.3920.015HbAlc0.4820.038HOMA-IR0.5010.012

2.5 T2DM合并骨質疏松危險因素的Logistic回歸分析

以T2DM患者是否合并骨質疏松為因變量，以年齡、FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C、25(OH)D、PPAR-γ mRNA、PINP、β-CTX、HbAlc、HOMA-IR、OPG指標作為自變量，納入四組行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，25(OH)D、PINP、HDL-C是T2DM患者合并骨質疏松的獨立保護因素，PPAR-γ mRNA、β-CTX、HbAlc、OPG是T2DM患者合并骨質疏松的獨立危險因素(見表6)。

表6 T2DM患者合并OP危險因素的Logistic回歸分析

Table 6 Logistic regression analysis of risk factors associated with OP in T2DM patients

變量回歸系數Wald χ2值P值OR(95% CI)HbA1c/%-7.05122.1470.0294.304(3.582,10.372)PPAR-γ mRNA6.3672.3520.0175.238(2.174,9.234)β-CTX/(μg/L)2.6256.3460.0453.134(2.018,5.134)OPG/(ng/L)3.4631.3420.0372.436(1.353,4.358)25(OH)D/(ng/mL)-1.1684.4670.0240.377(0.121,0.798)PINP/(μg/L)-0.2362.2230.0180.134(0.044,0.891)HDL-C/(mmol/L)-0.3533.4560.0460.662(0.002,0.934)

3 討論

骨質疏松癥是一種以骨量低下，骨微結構破壞，導致骨脆性增加，易發生骨折為特征的全身性骨病[9]。研究[10]發現，骨質疏松與糖尿病的關系密切。近年有研究[11-12]報道，PPAR-γ mRNA表達與糖尿病、OP密切相關，然而在不同骨量狀態下2型糖尿病患者外周血中表達如何，目前國內外未見相關研究報道。因此，本研究擬通過比較健康對照者與T2DM合并不同骨量患者外周血中PPAR-γ mRNA表達水平，探討OPG、25(OH)D、PPAR-γ mRNA調控糖、脂代謝及骨量的可能機制。

PPARγ是細胞核受體超家族的一員，PPARγ可促進骨髓間充質基質細胞向脂肪細胞分化[13]。本研究結果顯示，T2DM患者外周血PPAR-γ mRNA的表達比正常對照組顯著升高，并且隨著骨密度的變化，骨量正常→骨量減少→骨質疏松患者外周血PPAR-γ mRNA的表達逐漸增加。研究[14]表明，PPAR-γ mRNA的表達可促進骨髓內脂肪細胞數目不斷增多、體積增大，使骨髓腔內微環境發生改變，從而引起骨髓脂質代謝紊亂，骨髓間充質基質細胞向成骨細胞的分化減少，破骨細胞的形成及活化增多，成骨、破骨細胞偶聯失調，最終導致骨質疏松。因此，高水平的PPAR-γ mRNA表達參與了骨髓間充質細胞向脂肪細胞轉化的過程，加快了骨質疏松的進程。OPG的主要作用是影響骨代謝，抑制破骨細胞的發生分化、活化成熟及促進其凋亡[15]。研究發現，48～65歲女性的血清水平明顯升高，顯示絕經女性體內水平高于未絕經女性，推測雌激素缺乏時破骨細胞功能活躍，骨吸收增加，骨量丟失加快，刺激機體代償性骨形成增加，血清OPG相應增加[16]。且近年糖尿病研究[17]顯示，糖尿病患者血清中OPG水平顯著增高，然而具體機制尚未有統一定論。β-CTX、PINP是反應骨轉化的常用生化指標，分別代表骨吸收和骨形成[18]。此外，高血糖、低HDL-C、高血壓及內皮損傷等因素均可影響 PPAR-γ mRNA表達[19]。本研究還發現，血漿中25(OH)D、PINP、HDL-C水平與外周血PPAR-γ mRNA的表達呈負相關，β-CTX、HbAlc、HOMA-IR、OPG與PPAR-γ mRNA表達呈正相關。隨著骨量的下降，血清中25(OH)D、PINP、HDL-C水平逐漸下降(NC組>A組>B組>C組)，而PPAR-γ mRNA、β-CTX、HbA1c、OPG水平逐漸升高(NC組

綜上所述，T2DM合并骨質疏松患者往往合并脂代謝紊亂，并且隨著骨密度的減少，血清中25(OH)D水平逐漸降低，外周血中PPAR-γ mRNA的表達逐漸增加。提示血清中25(OH)D的降低，可能通過上調外周血中PPAR-γ mRNA表達，從而導致糖、脂、骨的代謝紊亂，參與糖尿病、骨質疏松的發生發展。因此，T2DM患者加強血糖控制的同時，關注血清25(OH)D及外周血PPAR-γ mRNA表達水平，可能對防治糖尿病、OP有一定的作用，但其具體機制有待進一步研究探索。