微小RNA-148a-3p在尋常型銀屑病患者外周血CD4+T淋巴細胞中的表達及臨床意義

曾菁莘 田歆 朱慧蘭 張錫寶 林玲 張麗丹 劉煒鈺 羅權

1廣州醫科大學皮膚病研究所 廣州市皮膚病防治所皮膚科 510095；2廣州醫科大學附屬第三醫院皮膚科 510150

銀屑病是一種多基因遺傳背景下由T淋巴細胞介導的慢性炎癥性增生性疾病［1］。T細胞亞群的免疫失衡在銀屑病發病中起重要作用［2］。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類高度保守的非編碼小分子單鏈RNA，在調節角質形成細胞增殖分化、皮膚炎癥及免疫細胞之間的相互影響等方面發揮重要作用［3］。miRNA-148a-3p是一種缺氧誘導的miRNA［4］，缺氧是多種病理條件如炎癥、組織缺血及實體瘤等的共同特征［5］。研究表明，miRNA-148a-3p在T細胞及B細胞介導的慢性炎癥性疾病、自身免疫性疾病及癌癥的發生發展中起重要的調控作用［6-7］，但其在尋常型銀屑病中的表達及其對CD4+T淋巴細胞的調控作用及機制尚不清楚。我們通過分析miRNA-148a及其潛在靶基因B淋巴細胞瘤2相互作用的細胞死亡調節因子（bcl-2 interacting mediator of cell death，Bim）在尋常型銀屑病患者外周血中的表達，探討miRNA-148a-3p可能的調控作用。

對象與方法

一、對象

收集2017年7月至2018年4月就診于廣州市皮膚病防治所的20例尋常型銀屑病患者。男11例，女9例，年齡18～62（41.55±13.74）歲。納入標準：結合臨床表現及皮損組織病理確診為尋常型銀屑病的患者。排除標準：近3周外用糖皮質激素及免疫抑制劑；近1個月系統應用糖皮質激素、阿維A、免疫抑制劑等，有紫外線治療及日光浴史；有心臟、肝、腎疾病及精神疾病者；處于感染、妊娠、分娩、外傷等應激狀態；有惡性腫瘤者。病情嚴重程度采用銀屑病面積及嚴重程度評分法（PASI）評估。健康對照組20例，為本院工作人員，均無系統性疾病及自身免疫性疾病家族史，其中男13例，女7例，年齡22～42（29.32±9.45）歲。本研究經廣州市皮膚病防治所醫學倫理委員會批準（批件號201717），受試者均簽署知情同意書。

二、主要試劑及儀器

EasySep?直接人CD4+T細胞分選（負選）試劑盒（加拿大Stemcell公司），總RNA抽提試劑Trizol（美國Invitrogen公司），牛血清白蛋白（BSA）（美國Sigma公司），DMEM培養基、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰酶（美國Gibco公司），雙熒光素酶報告檢測試劑盒（美國Promega公司），miRNA熒光定量PCR試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司），兔抗人Bim單克隆抗體、山羊抗兔二抗（英國Abcam公司），DynaMag?磁體（美國Thermo公司）。

三、方法

1.CD4+T淋巴細胞分選：抽取受試者外周靜脈血10 ml。采用EasySep?直接人CD4+T細胞分選（負選）試劑盒分選CD4+T淋巴細胞，使用抗體復合物和磁珠標記紅細胞、血小板和不需要的細胞，用EasySep?磁極將磁珠標記的非目的細胞與未經標記的CD4+T細胞分離，將目的細胞轉入新試管中，流式細胞儀檢測細胞純度，臺盼藍法計數，每管約3×106個分裝，離心后吸干上清液，將細胞沉淀于-80℃凍存。

2.實時熒光定量PCR（qPCR）檢測CD4+T細胞中miRNA-148a的表達：用Trizol試劑提取受試者外周血CD4+T細胞總RNA，采用紫外可見光分光光度計測定RNA濃度，以A260/A280比值判定純度。通過逆轉錄試劑盒進行逆轉錄獲得miRNA-148a-3p的cDNA，以U6作為內參，熒光定量PCR檢測miRNA-148a-3p的表達，引物（編號ssD089261711、ssD809230166、ssD809230858、ssD0904071006、ssD0904071007、ssD0904071008）由廣州銳博生物科技有限公司設計并合成，反應體系的配制及反應條件的設置均按照熒光定量PCR試劑盒說明書進行，采用2-ΔΔCt計算miRNA-148a-3p相對表達量。

3.miRNA-148a-3p靶基因的預測與驗證：通過Mirbase/Targetscans/PicTar等生物信息學軟件篩選出一系列與尋常型銀屑病發病機制密切相關的9條靶基因WNT1、IGF1、BCL2L13、BCL2L11、EGFR、DNMT1、EGR3、HMGB3、MITF，其中BCL2L11基因編碼的Bim已被證實參與自身免疫調控，因此選擇Bim基因開展靶基因驗證。

（1）雙熒光素酶載體的構建：根據人BCL2L11-3′UTR序列信息設計其擴增引物，即h-BCL2L11-3UTR-F（3298）（XhoI）：5′-GGCGCTCGAGCAACTC AGCGTTTAGAAAAGAAATA-3′；h-BCL2L11-3UTR- R （4127） （NotI） ： 5′ -AATGCGGCCGCAGTGGCAATT ACCCTGTCAAA-3′，其中下劃線標出的序列為XhoI、NotI兩個酶切位點。將含有miRNA-148a-3p結合位點的BCL2L11 3′UTR序列的片段克隆到pMIR-REPORT?雙螢光素酶報告載體中，獲得野生型h-BCL2L11-3UTR報告基因載體；在構建好的野生型報告基因載體基礎上，利用點突變PCR將miRNA-148a-3p的結合位點突變為互補序列，獲得突變型h-BCL2L11-3UTR報告基因載體。

（2）雙熒光素酶報告系統檢測：將293T細胞分成兩組，分別轉染含野生型（WT）和突變型（MUT）BCL2L11 3′UTR的質粒，再將上述兩組細胞分成兩個亞組，分別轉染miRNA-148a-3p模擬物（miRNA-148a-3p亞組）和陰性對照模擬物（陰性對照亞組），報告基因與模擬物共轉染48 h后，利用雙熒光素酶報告檢測試劑盒進行雙熒光素酶檢測，以熒光照度計測定熒光值。

4.Westen印跡法檢測CD4+T細胞中Bim蛋白水平：檢測11例銀屑病患者及8例健康對照CD4+T細胞中Bim蛋白的水平。通過蛋白裂解液在冰上充分裂解CD4+T細胞60 min，BCA法測蛋白濃度。制備十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，常規電泳后將凝膠轉移至硝酸纖維素膜上。取出轉移膜，用3%BSA封閉。結束后將膜用TBST緩沖液漂洗1次，然后加入含3%BSA的抗Bim抗體（稀釋2 000倍），放入4℃冰箱孵育過夜。次日，回收一抗，放入-20℃冰箱。將膜用TBST漂洗3次，然后加入含3%BSA的山羊抗兔IgG二抗（稀釋3 000倍），在搖床上室溫孵育1 h后，用TBST緩沖液漂洗3次，加入ECL發光劑處理并發光顯像、拍照，根據目的條帶的灰度值分析蛋白表達水平。

四、統計學方法

結果

一、CD4+T細胞中miRNA-148a-3p表達水平

由受試者外周血樣本提取的RNA濃度為3.49～57.42 mg/L，去除濃度低于20 mg/L的樣品后，剩余18份患者及12份對照標本。18例尋常型銀屑病患者中，男10例，女8例，年齡23～58（37.45±9.46）歲；健康對照組12例中，男7例，女5例，年齡24～42（32.33±6.10）歲。兩組患者年齡（t=1.65，P＞0.05）和性別分布（χ2=0.02，P＞0.05）差異均無統計學意義。尋常型銀屑病組miRNA-148a-3p相對表達水平（2-ΔΔCt）為5.61±1.66，健康對照組為1.00±0.26，兩組差異有統計學意義（U=12，P＜0.05）。

二、miRNA-148a-3p表達量與PASI評分的相關性分析

18例尋常型銀屑病患者PASI評分為2.5～20.6（7.77±4.47）分，Spearman相 關分 析 顯示，miRNA-148a-3p表達量與PASI評分呈正相關，r=0.93，P＜0.001。見圖1。

三、miRNA-148a-3p靶基因驗證

成功構建報告基因載體后，雙熒光素酶報告檢測結果示（圖2）：與陰性對照亞組相比，WT-Bim 3′UTR組中miRNA-148a-3p亞組熒光素螢光素酶活性明顯下調（t=6.52，P＜0.05），而MUT-Bim 3′UTR組中miRNA-148a-3p亞組差異無統計學意義（t=1.73，P＞0.05）。

四、CD4+T細胞中Bim蛋白的水平

尋常型銀屑病患者組CD4+T細胞中Bim蛋白的表達水平為0.69±0.07，健康對照組為0.93±0.06，兩組差異有統計學意義（t=4.38，P＜0.01）。見圖3。

五、尋常型銀屑病患者CD4+T細胞中Bim水平與PASI評分的相關性

11例尋常型銀屑病患者PASI評分為2.8～10.5（6.82±2.12）分，與外周血CD4+T細胞中Bim表達量呈負相關（r=-0.774，P＜0.01）。見圖4。

討論

圖1 18例尋常型銀屑病患者外周血CD4+T細胞miRNA-148a-3p表達量與銀屑病皮損面積和嚴重程度指數（PASI）呈正相關

圖2 雙熒光素酶報告驗證miRNA-148a-3p可靶向作用Bim3′UTR Luc/Rluc比值：代表熒光素酶活性。a：兩組間比較，P＜0.05。1：轉染野生型BCL2L11 3′UTR質粒和陰性對照模擬物組；2：轉染野生型BCL2L11 3′UTR質粒和miRNA-148a-3p模擬物組；3：轉染突變型BCL2L11 3′UTR質粒和陰性對照模擬物組；4：轉染野生型BCL2L11 3′UTR質粒和miRNA-148a-3p模擬物組

銀屑病皮損表皮和真皮內有大量T細胞浸潤，CD4+T細胞在皮膚歸巢前就已活化，活化后的CD4+T細胞主要向Th1、Th17和Th22淋巴細胞分化，釋放促炎癥細胞因子進一步招募異常活化淋巴細胞，刺激角質形成細胞增殖從而誘導銀屑病發生發展［8］。miRNA是細胞生長、增殖分化、凋亡及信號轉導的關鍵調節物質，近年來研究發現多種miRNA在銀屑病皮損中表達改變，如miRNA-30e-5p、miRNA-192-5p、miRNA-17-3p在皮損中表達下調，而miRNA-320c、miRNA-let-7a-5p、miRNA-125b-5p、miRNA-642a-5p、miRNA-29a-5p表達則明顯上調［9］，部分miRNA被證實可通過作用于特定靶基因參與調控銀屑病皮損組織的炎癥反應。Liu等［10］研究表明，miRNA-148a-3p可靶向作用于蛋白激酶CaMKIIα從而削弱樹突細胞的抗原提呈及固有免疫，蛋白激酶CaMKIIα還可降低MHC-Ⅱ類分子的表達。然而，miRNA參與調控尋常型銀屑病免疫細胞異?；罨瘷C制的研究目前仍較少見。Wu等［11］研究表明，過表達的miRNA-210通過調控靶基因STAT6和LYN促進Th17和Th1細胞分化，抑制Th2細胞分化，從而促進銀屑病皮損形成。本研究顯示，尋常型銀屑病患者外周血CD4+T淋巴細胞miRNA-148a-3p表達高于健康對照組，且其與尋常型銀屑病病情相關，提示miRNA-148a-3p的異常表達可能在尋常型銀屑病患者T細胞中發揮重要作用。

此外，微環境中如缺氧和細胞因子等改變也會影響miRNA-148a-3p的表達。Hsiao等［12］研究發現，在子宮內膜異位癥中低氧可通過AUF1/miRNA-148a-3p通路使DNA甲基化轉移酶1（DNMT1）失調從而引起整體低甲基化。Porstner等［13］研究發現，活化的B細胞可上調miRNA-148a-3p的表達，miRNA-148a-3p上調后又可促進活化的B細胞分化成漿細胞，并且通過抑制轉錄因子BTB-CNC異體同源體2（BTB and CNC homolog 2，Bach2）、小眼畸形 轉 錄 因 子（microphthalmia transcription factor，MITF）及張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）來增強漿細胞的存活率。以上研究提示，miRNA-148a在調控細胞凋亡中發揮重要作用。我們通過多個生物信息學軟件及權威數據庫分析出促凋亡蛋白Bim為miRNA-148a-3p的潛在靶基因之一，隨后構建熒光素酶報告載體證實miRNA-148a-3p對Bim基因的表達具有直接調控作用。Bim是miRNA-148a-3p靶基因之一，作為一種重要的凋亡調節蛋白，在自身免疫性疾病及腫瘤的發生發展中有重要作用［14］。Kim等［15］研究表明，上調miRNA-148a-3p可沉默有絲分裂誘導基因6（mitogen-induced gene 6，MIG6）和Bim的表達從而抑制神經膠質瘤細胞凋亡。我們發現，Bim在尋常型銀屑病組外周血的表達低于健康對照組，且與銀屑病嚴重程度呈負相關，這進一步說明miRNA-148a-3p可能通過靶向作用促凋亡蛋白Bim參與尋常型銀屑病外周血CD4+T細胞的分化及凋亡機制，故有必要針對miRNA-148a-3p及其調節的T細胞亞群進行深入研究，揭示其在尋常型銀屑病中的作用機制。

圖3 Western印跡檢測銀屑病患者（條帶1、5、6、7）及健康對照（條帶2、3、4、8）外周血CD4+T細胞中Bim蛋白的表達水平

圖4 11例尋常型銀屑病患者外周血CD4+T細胞Bim表達量與銀屑病皮損面積和嚴重程度指數（PASI）呈負相關

綜上所述，miRNA-148a-3p在尋常型銀屑病外周血CD4+T細胞中過表達，且可靶向調節促凋亡蛋白Bim的表達，在尋常型銀屑病的發生過程中具有重要的作用，而Bim蛋白表達下調可能打破T細胞亞群的平衡從而促進銀屑病的發生發展。以miRNA-148a-3p為靶點進行研究，有望為尋常型銀屑病的免疫學機制及治療的研究提供新的思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突