紫外線及全反式維A酸對人皮膚及成纖維細胞中Hrd1表達的影響

成仙葉 錢雯 金軼 李謝倫 蘇東明 陳斌

1南京醫科大學第一附屬醫院皮膚科 210029；2南京醫科大學代謝疾病研究中心 210029

紫外線照射可以引起皮膚成纖維細胞產生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）［1-2］，促發細胞內內質網應激（ER stress），這一過程在紫外線誘導的皮膚損傷中發揮重要作用［3-4］。內質網應激通過激活內質網相關蛋白降解（ER-associated degradation，ERAD），促進內質網內未折疊或錯誤折疊蛋白質的降解［5］。羥甲基戊二酰輔酶A還原酶降解蛋白1（Hrd1）是ERAD過程中一種重要的E3泛素連接酶，可以通過介導多種蛋白質降解，在腎纖維化、類風濕性關節炎、肝硬化等疾病的發生發展過程中發揮重要作用［6-8］，同時不少研究證實，Hrd1是多種抗光老化蛋白質［如NF-E2相關因子2（Nrf2）、胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R）］的特異性E3泛素連接酶，介導其泛素化降解［7，9］。我們前期研究發現，紫外線照射可明顯促進皮膚成纖維細胞內Hrd1的表達［10］。為了進一步證實Hrd1是否參與光老化的發生，我們通過收集臨床標本及建立小鼠光老化模型，進一步明確紫外線照射與皮膚Hrd1表達水平的關系。全反式維A酸（ATRA）是臨床上公認的可治療光老化的外用藥物，其機制包括抑制激活蛋白-1轉錄因子、抑制基質金屬蛋白酶（MMP）的表達及增加真皮膠原纖維量［11］。本研究通過在動物和細胞學實驗中加入ATRA處理，觀察ATRA處理后Hrd1的表達，探索ATRA治療皮膚光損傷的分子機制。

材料與方法

一、主要試劑與儀器

Hrd1（SYVN1）一抗（兔抗人多克隆抗體，美國Abcam公司）、PV-6000試劑盒（北京中杉金橋有限公司）、羊抗兔二抗（美國Thermo公司）、ATRA（R2625，美國Sigma公司，純度＞98%，用二甲基亞砜溶解配制）、噻唑藍（MTT）（美國Sigma公司）、ROS檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）、Bio-spectra紫外照射系統（法國Vilber Lourmat公司）、熒光顯微鏡（DP70，日本東京Olympus公司）。清潔級BALB/c小鼠由上海斯來克實驗動物中心，合格證號SCXK（滬）2007-0005，動物實驗許可證號220181352。江蘇省疾病控制中心（SPF）動物實驗室喂養，各實驗組小鼠按雌雄分組分開，全價顆粒飼料喂養，飲清潔自來水，室內恒溫22℃。

二、方法

1.臨床標本收集：臨床皮膚標本來自2017年12月至2018年6月南京醫科大學第一附屬醫院皮膚科患者淺表良性腫物病灶周圍正常皮膚，曝光部位皮膚取自面頸部及手腕，避光部位皮膚取自胸背部、大腿及臀部。標本取自12例女性，均為室內工作者，年齡32～70歲。根據年齡及部位將標本分為4組，每組3份，組1來自30～40歲曝光部位，組2來自30～40歲避光部位，組3來自60～70歲曝光部位，組4來自60～70歲避光部位。本研究通過南京醫科大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準（2016-SRFA-033），患者均簽署知情同意書。

2.動物分組及處理：清潔級BALB/c小鼠（月齡3周，雌雄各20只）隨機分為對照組、紫外線組、紫外線+ATRA組、ATRA組，每組4只。造模方法參照文獻［12］，紫外線組、紫外線+ATRA組每日同時照射UVA 10 J/cm2和UVB 30 mJ/cm2；紫外線+ATRA組（照光前給藥）、ATRA組小鼠在背部剃毛區每日均勻涂抹1次0.1 ml 0.1%ATRA乳膏（重慶華邦制藥公司）；對照組不涂藥，不照射紫外線。14周后處死小鼠并取小鼠背部脫毛區全層皮膚。

3.免疫組化檢測皮膚中Hrd1表達：12份人皮膚組織和小鼠皮膚組織標本用10%甲醛固定，石蠟包埋、切片、脫蠟，抗原修復。滴加內源性過氧化物酶阻斷劑，常溫孵育，再滴加Hrd1一抗（濃度1∶200），4℃過夜，滴加酶標羊抗小鼠/兔IgG聚合物，37℃孵育；二氨基聯苯胺染色液顯色，最后復染、脫水、透明、封片。使用DP2-BSW軟件分析并采集圖片，用Image J軟件在平均像素強度相同的區域測定染色強度即平均光密度值。

4.細胞分組：取包皮環切手術患者的包皮標本（患者均簽署知情同意書），分離培養原代人成纖維細胞，方法參照文獻［10］。選用4～8代處于對數生長期的細胞進行實驗。細胞分為對照組、紫外線組、ATRA+紫外線組及ATRA組。紫外線組和ATRA+紫外線組照光前用PBS覆蓋細胞上層，照射劑量為10 J/cm2UVA或30 mJ/cm2UVB。ATRA+紫外線組（紫外線照射后）和ATRA組用含1 μmol/L ATRA（濃度參考文獻［13-14］）的DMEM培養基繼續培養24 h，收集細胞用于后續實驗。

5.Western印跡法檢測成纖維細胞中Hrd1的表達：將各組人皮膚成纖維細胞在冰PBS中洗2遍，然后在RIPA裂解緩沖液中溶解。將含有等量蛋白的樣品上樣后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉印到硝酸纖維素膜上。室溫下，用5%脫脂奶粉封閉非特異性蛋白1 h。加入Hrd1一抗，-4℃冰箱中過夜。TBST洗3次，每次5 min，加入過氧化物酶標記的二抗室溫下結合1 h。采用ECL化學發光試劑反應5 min，利用凝膠自動成像儀成像。采用Image J軟件進行半定量分析，數據表達為Hrd1蛋白灰度值與內參蛋白灰度值的比值。

6.細胞內ROS檢測：使用ROS檢測試劑盒檢測各組人成纖維細胞內ROS水平。將用PBS沖洗處理后的細胞加入含有10 μmol/L CM-H2DCFDA培養液中37℃孵育30 min，無血清培養液沖洗3次。通過測定2′，7′-二氯熒光素評估ROS水平。使用熒光顯微鏡觀察2′，7′-二氯熒光素。

三、統計學方法

結果

一、Hrd1在人體皮膚的表達

見圖1。不同年齡段人皮膚標本中，均可發現成纖維細胞Hrd1的表達，30～40歲患者曝光部位皮膚組織中Hrd1表達（0.307±0.256）明顯高于避光部位（0.196±0.330）（t=5.486，P=0.032）；60～70歲患者曝光部位（0.486±0.579）亦明顯高于避光部位（0.199±0.375）（t=10.579，P=0.009）。

二、紫外線及ATRA對小鼠皮膚中Hrd1表達的影響

對照組、紫外線組、紫外線+ATRA組及ATRA組小鼠皮膚中Hrd1蛋白水平分別為0.189±0.015、0.288±0.017、0.187±0.020、0.226±0.021，差異有統計學意義（F=19.553，P＜0.001），紫外線組高于對照組（t=5.337，P=0.033）和紫外線+ATRA組（t=4.891，P=0.039）。見圖2。

三、紫外線照射及ATRA對培養的人皮膚成纖維細胞Hrd1表達的影響（圖3）

UVA照射時，對照組、紫外線組、紫外線+ATRA組及ATRA組人皮膚成纖維細胞中Hrd1蛋白水平分別為0.183±0.008、0.866±0.082、0.642±0.043、0.265±0.041，差異有統計學意義（F=120.704，P＜0.001），其中紫外線組高于對照組（t=13.437，P=0.005）和ATRA+紫外線組（t=4.341，P=0.048）。

圖1 免疫組化法檢測人皮膚組織中Hrd1的表達曝光部位皮膚中Hrd1較同年齡避光部位的表達明顯升高（×200），左下角小圖中黑色箭頭處為成纖維細胞（×400）

圖2 免疫組化法檢測慢性紫外線照射及外用全反式維A酸（ATRA）對小鼠皮膚中Hrd1表達的影響（×400）紫外線組小鼠皮膚中Hrd1表達較對照組明顯升高，ATRA+紫外線組小鼠皮膚中Hrd1表達較紫外線組明顯下降（紅色箭頭處為成纖維細胞）

UVB照射時4組人皮膚成纖維細胞Hrd1蛋白水平分別為0.424±0.007、1.036±0.077、0.691±0.036、0.356±0.062，差異亦有統計學意義（F=102.119，P＜0.001），其中紫外線組高于對照組（t=12.524，P=0.006）和ATRA+紫外線組（t=9.920，P=0.01）。

四、紫外線及ATRA對人皮膚成纖維細胞內ROS水平的影響（圖4）

圖3 Western印跡法檢測紫外線及全反式維A酸（ATRA）對人成纖維細胞中Hrd1表達的影響紫外線組Hrd1的蛋白水平均高于對照組，ATRA+紫外線組Hrd1蛋白水平均低于紫外線組

圖4 紫外線及全反式維A酸（ATRA）對細胞內活性氧（ROS）水平的影響4A：熒光顯微鏡觀察各組內ROS生成情況；4B、4C：各組ROS水平統計結果。a：P＜0.01；b：P＜0.05

UVA照射時，對照組、紫外線組、紫外線+ATRA組、ATRA組間人皮膚成纖維細胞內ROS水平差異有統計學意義（F=51.214，P＜0.001），紫外線組高于對照組（t=16.233，P=0.001）和ATRA+紫外線組ROS水平低于紫外線組（t=5.619，P=0.011）。UVB照射時，4組間ROS水平差異亦有統計學意義（F=44.735，P＜0.001），紫外線組高于對照組（t=11.925，P=0.001）和ATRA+紫外線組（t=14.557，P=0.001）。

討論

不論是UVA還是UVB都可以促進皮膚成纖維細胞中ROS的產生，激活細胞內內質網應激［15］。為了應對內質網應激，哺乳動物細胞內會激活一系列信號通路，統稱為未折疊蛋白反應（unfolded protein response）［3］，包括暫停早期蛋白質合成及誘導ERAD等。未折疊蛋白反應由位于內質網膜上的3個傳感器IRE1、PERK和ATF6發出信號［16］。Hrd1又稱作滑膜素（synoviolin），是未折疊蛋白反應中IRE1的下游效應器［8，17］。Xu等［9］研究發現，Hrd1通過特異性結合并降解IGF-1R抑制乳腺癌細胞的生長轉移。IGF-1R也是重要的促進皮膚成纖維細胞膠原合成的分子［18］，還可增強紫外線照射后皮膚角質形成細胞的生存率［19］。Wu等［7］在研究肝硬化時發現Hrd1作為Nrf2的特異性E3泛素連接酶，通過降解Nrf2加重細胞的氧化損傷。Nrf2也是皮膚成纖維細胞中重要的抗氧化損傷蛋白［20］。目前已證實Hrd1的特異性結合底物Nrf2及IGF-1R均在抵抗皮膚光老化中發揮重要作用，而Hrd1本身在光老化中的作用還不明確。

我們在前期研究中通過用紫外線照射人皮膚成纖維細胞，發現紫外線可誘導Hrd1表達增高［10］。本次實驗中，我們收集12例臨床標本，發現在不同年齡段皮膚組織中，曝光部位Hrd1的表達水平明顯高于避光部位；同時，在慢性紫外線照射的小鼠皮膚中Hrd1的表達也明顯增高。進一步證實紫外線照射可以顯著增加Hrd1的表達，也提示Hrd1可能參與光老化的發病機制。

ATRA是臨床治療光老化的經典藥物［11］，其機制主要是抑制紫外線誘導的基質金屬蛋白酶的產生以及促進膠原合成［21-22］。我們發現，外用ATRA乳膏處理的小鼠皮膚在慢性紫外線照射后，皮膚Hrd1的表達較單純照光組降低。體外實驗中，我們也觀察到ATRA處理可以使細胞Hrd1蛋白水平較單純照光組下降。這些結果均提示Hrd1可能是ATRA的治療靶點。我們還驗證了ATRA處理可以抑制紫外線誘導的細胞內ROS生成，結果與文獻報道一致［23］。細胞內ROS的大量產生是激活未折疊蛋白反應的基礎，故而推測ATRA抑制紫外線誘導的Hrd1高表達可能與ATRA抑制細胞ROS生成有關。

綜上，本研究證實了紫外線照射不論在體外還是體內都可以顯著提高皮膚成纖維細胞中Hrd1的表達，而ATRA可以抑制這一過程，其機制可能與ATRA抑制細胞內ROS產生有關。但Hrd1在光老化過程中發揮作用的具體機制還需要進一步探索。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突