重組枯草芽孢桿菌表達4-木糖醇脫氫酶的發酵和反應條件優化

朱雯惠，孟青，江波，張濤

(食品科學與技術國家重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

國際稀有糖協會(International Society of Rare Sugar，ISRS)將稀有糖定義為：自然界中存在但含量極少的一類單糖及其衍生物[1]。例如，L-葡萄糖、D-阿洛酮糖、D-塔格糖、木糖醇和L-木酮糖等都屬于稀有糖[2]。其中，L-木酮糖是一種戊酮糖，還是各種原核和真核生物體內的代謝中間產物[3]。雖然它在自然界中含量稀少，但是卻在一些領域發揮著重要的功能和作用。L-木酮糖是α-葡萄糖苷酶的高效抑制劑[4]，已有以L-木酮糖作為主要成分的降血糖藥物，可以用來降低糖尿病患者血液中的葡萄糖水平[5]。此外，它還可以作為前體物質來生產其他稀有糖，如L-來蘇糖[6]、L-木糖[7]和L-核糖[8]。

4-木糖醇脫氫酶又稱為L-木酮糖還原酶(EC 1.1.1.10)，與短鏈脫氫酶/還原酶家族成員有高度相似性[9]，可催化木糖醇與L-木酮糖之間的相互轉化。目前，已報道的含有這種酶的細菌分別為噬夏孢歐文氏菌(后改名為菠蘿泛菌)(Pantoeaananatis)[10]、產堿桿菌(Alcaligenes)[11]、蒼白芽孢桿菌(Bacilluspallidus)[12]和巨大芽胞桿菌(Bacillusmegaterium)[13]。基于生物轉化生產L-木酮糖，主要是通過菌體靜息細胞催化氧化底物木糖醇。此方法條件溫和、工藝簡單，且木糖醇價格相對低廉，因此利用4-木糖醇脫氫酶轉化木糖醇是生產L-木酮糖的理想方法[14]。

4-木糖醇脫氫酶的工程菌表達宿主主要為大腸桿菌[15-16]，還未有研究表明其在枯草芽孢桿菌中成功表達。并且，我國在稀有糖的研究方面主要集中于木糖醇、赤蘚糖醇等[17-20]，關于L-木酮糖的研究較少，而其在食品與醫藥等方面的重要作用不可小覷[21]，因此優化具有轉化木糖醇生產L-木酮糖能力的菌株，對L-木酮糖的研究具有很大的價值和意義。作者所在課題組前期研究中，實現了4-木糖醇脫氫酶在質粒型枯草芽孢桿菌工程菌中的表達。本實驗將對已構建的枯草芽孢桿菌工程菌發酵條件以及靜息細胞反應條件進行優化以提高酶活，從而提高木糖醇的轉化率和木酮糖得率。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)宿主菌株1A751(XDH來源于PantoeaananatisATCC 43072)為實驗室構建并保存。

L-木酮糖標品，百靈威公司；木糖醇，上海生工；其他試劑，均購買自國藥集團(分析純)。

1.1.2 培養基

平板分離培養基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，瓊脂20。121 ℃滅菌15 min，保溫。

(LB)種子培養基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10。121 ℃滅菌15 min。

基礎發酵培養基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10。121 ℃滅菌15 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 平板培養

在無菌環境中，用接種環蘸取保藏甘油管中的菌體，平板劃線。將平板置于37 ℃恒溫培養箱中過夜培養，封口置常溫保藏。

1.2.2 種子培養

在無菌超凈臺中，挑取平板上的單菌落，接種到含30 mL種子培養基的250 mL錐形瓶中，37 ℃，200 r/min搖床過夜培養。

1.2.3 發酵培養

在無菌環境中，將種子液接種1 mL到含30 mL發酵培養基的250 mL錐形瓶中，37 ℃培養12 h，轉速200 r/min。發酵培養基結束后，取發酵液離心(5 000 r/min，8 min)，棄去離心得到的上清，收集菌體，用生理鹽水洗滌2次(5 000 r/min，8 min)，洗去發酵液，得到待反應的靜息細胞。

1.2.4 靜息細胞反應

反應體系：取1 mL發酵菌液12 000 r/min離心，2 min后收集菌體，用等體積20 g/L的木糖醇溶液(用pH 10.0,50 mmol/L的甘氨酸-NaOH溶液配制)重懸菌體。反應條件：37 ℃水浴，反應時間3 h。反應結束后離心(12 000 r/min，2 min)，取上清液，通過半胱氨酸咔唑法[22]測定產物L-木酮糖的含量。

酶活力單位定義：每升發酵液每分鐘產生1 μmolL-木酮糖所需要的酶量為1個活力單位，以U表示。

半胱氨酸咔唑法測定產物L-木酮糖的含量：靜息細胞反應結束后離心，取經過適當稀釋的反應上清液，加入0.2 mL 15 g/L的半胱氨酸鹽酸鹽溶液，6 mL體積分數為70%的硫酸溶液，立即振蕩搖勻，再加入0.2 mL 1.2 g/L咔唑酒精溶液，搖勻后放入60 ℃水浴，保溫10 min，室溫冷卻10 min。以木糖醇及反應緩沖液作為空白調零，在560 nm處測定吸光度[23]。通過標準曲線，計算生產的木糖醇含量，進而計算活力。

1.2.5 菌體生長量的測定

取1 mL發酵液，離心(12 000 r/min，2 min)后獲得菌體，置于烘箱烘干24 h至恒重，稱重，即菌體生長量。

1.2.6 發酵培養基成分和發酵培養條件的影響

通過單因素優化實驗確定菌株XDH發酵培養基中的最適碳源、氮源、金屬離子、發酵溫度、初始pH值、裝液量和接種量，以 4-木糖醇脫氫酶活力和菌株生長量(干重)為主要指標。

(1)碳源種類及濃度。選取葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、α-乳糖、D-半乳糖、木糖醇、甘露醇和甘油10種碳源。

(2)氮源種類及濃度。選取硫酸銨、尿素、牛肉膏、胰蛋白胨、酵母膏和氯化銨6種常見微生物發酵所需氮源。在基礎發酵培養基的基礎上，加入各氮源，以10 g/L胰蛋白胨的含氮量為基準，計算含氮量，使所有氮源含氮量相同。

(3)金屬離子種類及濃度。以基礎發酵培養基為基礎，添加不同濃度的Mg2+、Mn2+、Fe2+、Ca2+。

(4)發酵培養溫度。本實驗選取28、37和45 ℃這3個常見的發酵培養溫度進行實驗。

(5)發酵培養基初始pH值。基礎發酵培養基的pH值約為5，因此實驗取初始pH值為5、6、7、8、9、10和11。

(6)發酵培養基裝液量。分別選取發酵培養基的裝液量為10、20、30、40和50 mL。

(7)發酵培養基接種量。種子于培養基中活化培養12 h后，分別取0.3、0.5、1、2、3、4、5、6 mL種子液，接種到發酵培養基中進行發酵培養。

(8)基礎培養條件。接種量1 mL/30 mL，培養溫度：37 ℃，200 r/min，培養時間12 h。

1.2.7 靜息細胞反應條件的影響

為獲得較高的轉化率，實驗研究了反應溫度、緩沖體系pH值以及底物質量濃度對轉化效果的影響。

底物質量濃度。以pH為10.0的甘氨酸-NaOH緩沖溶液配制濃度為5、10、20、50和100 g/L的木糖醇溶液。

反應溫度。分別在25、30、35、37、40、45和50 ℃恒溫水浴中反應3 h，檢測不同反應溫度時的L-木酮糖含量。

緩沖溶液pH值。分別配制pH值為9.0、10.0、11.0的甘氨酸-NaOH緩沖溶液和pH為7.0、8.0、9.0的Tris-HCl緩沖溶液。

2 結果與討論

2.1 發酵培養基優化

2.1.1 碳源的選擇

以LB為基礎培養基，分別添加20 g/L的葡萄糖、果糖、麥芽糖、可溶性淀粉、α-乳糖、D-半乳糖、木糖醇、甘露醇、甘油為外加碳源，測定發酵酶活以及菌體生長量。以LB培養基為對照，酶活及菌體生長量，結果如圖1所示。

圖1 碳源種類對發酵產XDH的影響Fig.1 Effects of carbon sources on the production of XDH

由圖1可以觀察到，首先，與LB培養基相比，外加碳源的菌體生長量均有增長，但增長幅度有所差異；其次，與LB培養基相比，外加葡萄糖、蔗糖、α-乳糖、D-半乳糖、木糖醇、甘油這幾種碳源后，發酵酶活有所增長。基礎LB培養基的酶活為1.57 U/L，其中添加蔗糖一組的酶活最高，為3.64 U/L，提高2.32倍左右。

確定最優碳源為蔗糖后，分別測定蔗糖質量濃度為5、10、15、20、25、30、40 g/L時發酵液酶活以及菌體生長量，結果如圖2。

圖2 蔗糖質量濃度對發酵產XDH的影響Fig.2 Effects of sucrose concentration on the production of XDH

由圖2可知，與基礎培養基相比，加入蔗糖越多，菌體生長量越大，在15 g/L后菌體生長量保持恒定，不因添加量的增大而增大；但是發酵酶活隨著蔗糖的增加，出現先增加后降低，最后趨于平緩的趨勢。其中，在25 g/L處發酵酶活最高為4.05 U/L。由此，最優碳源為25 g/L蔗糖。

2.1.2 氮源種類及濃度

本實驗選擇硫酸銨、尿素、牛肉膏、胰蛋白胨、酵母膏和氯化銨6種常見微生物發酵所需氮源進行研究，在基礎發酵培養基的基礎上，加入上述各氮源，以10 g/L胰蛋白胨的含氮量為基準，計算其他各氮源濃度，使所有外加氮源的含氮量相同。對發酵酶活和菌體生長量進行測定，結果如圖3。

圖3 氮源種類對發酵產XDH的影響Fig.3 Effects of nitrogen sources on the production of XDH

由圖3可知，上述6種氮源對發酵酶活和菌體生長量均有不同程度的影響。其中，就菌體生長量來看，牛肉膏、酵母膏等有機氮源對菌體生長量的提高有顯著影響，而添加了尿素的培養基菌體生長量與基礎培養基相比并無顯著提高，但是得到的發酵絕對酶活最高；因此，基于顯著提高酶活的目的，選擇尿素作為最優氮源。

確定了尿素作為發酵培養基的最優氮源后，以1.0、1.5、3.0、4.5、5.0、10.0、15.0、20.0 g/L尿素為梯度優化最適氮源質量濃度，結果如圖4。

圖4 尿素質量濃度對發酵產XDH的影響Fig.4 Effects of urea concentration on the production of XDH

從圖4可以看到，發酵酶活隨著尿素濃度的增大，呈現出先升高后降低、15 g/L后的酶活趨于平緩的趨勢。其中，濃度在6 g/L時，發酵酶活顯著高于其他濃度，酶活達到4.73 U/L；尿素濃度高于6 g/L時，可能由于高濃度的尿素導致蛋白質變性、失去酶活，因此選擇6 g/L的尿素為最優氮源濃度。

2.1.3 金屬離子種類及濃度

以基礎發酵培養基為基礎，添加0.05 g/L的Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+，接種量1 mL/30 mL，37 ℃、200 r/min條件下，培養12 h。對菌株XDH在不同金屬離子存在條件下的菌體生長量和所產4-木糖醇脫氫酶的酶活進行考察，分析各金屬離子的影響，結果如圖5。

圖5 金屬離子對發酵產XDH的影響Fig.5 Effect of metal ions on the production of XDH

由圖5可知，不同的金屬離子對枯草芽孢桿菌的生長及酶活力都會產生一定程度的影響。其中Fe2+會產生顯著影響，可能是因為Fe2+是細胞色素氧化酶和過氧化氫酶的組成部分，也是發生有氧氧化的必要因素[24]；CaCl2雖然可以降低菌體的自溶，顯著提高菌體生長量，這與Ca2+能在發酵中控制細胞的透性有關，但是發酵酶活幾乎沒有提高[25]。因此，實驗進一步研究了Mg2+、Fe2+和Mn2+濃度對菌體所產生的影響。

選取質量濃度為0.05、0.1、0.2、0.4和0.6 g/L的MgSO4來分析不同濃度的Mg2+的影響，結果如圖6。

圖6 Mg2+質量濃度對發酵產XDH的影響Fig.6 Effect of Mg2+ concentration on the production of XDH

由圖6可知，不同質量濃度的Mg2+對發酵酶活和菌體生長量均有影響。其中，Mg2+從質量濃度0.05 g/L繼續增加會導致發酵酶活降低，而添加0.05 g/L的Mg2+得到的菌體酶活與空白相比提高近10%。因此，選擇0.05 g/L MgSO4。

此后，又通過實驗分析研究了不同質量濃度Fe2+的影響(圖7)。由圖7可以看出，Fe2+對發酵酶活和菌體生長量都會有一定程度的影響，隨著Fe2+質量濃度的逐漸增大，發酵酶活和菌體生長量的變化趨勢都是先提高后降低，兩者的峰值均出現在質量濃度為0.01 g/L的點。因此，選擇最適的FeSO4質量濃度為0.01 g/L。

圖7 Fe2+質量濃度對發酵產XDH的影響Fig.7 Effect of Fe2+ concentration on the production of XDH

此外，本文同時研究了不同濃度的Mn2+對發酵酶活和菌體生長量的影響(圖8)。

從圖8可以看出，Mn2+對發酵酶活和菌體生長量有不同程度的影響。其中，隨著Mn2+質量濃度的增大，菌體生長量曲線呈先增長后降低的趨勢，在0.02 g/L出現最高峰，而此處的發酵酶活遠遠低于0.01 g/L，所以選擇MnSO4的最適添加量為0.01 g/L。

圖8 Mn2+質量濃度對發酵產XDH的影響Fig.8 Effect of Mg2+ concentration on the production of XDH

2.2 發酵培養條件的影響

2.2.1 培養溫度

本文選取28、37和45 ℃這3個常見的發酵培養溫度進行實驗。對菌株XDH在不同溫度下的菌體生長量和所產4-木糖醇脫氫酶的酶活進行考察，分析發酵溫度的影響。結果如圖9。

圖9 培養溫度對發酵產XDH的影響Fig.9 Effect of fermentation temperature on the production of XDH

由圖9可知，3個常見培養溫度條件下，28 ℃的酶活和菌體生長量均為最高值，均遠高于37、45 ℃時，因此選擇28 ℃為最適發酵培養溫度。

2.2.2 發酵培養基初始pH值

基礎培養基的初始pH值約為5，本實驗通過用NaOH溶液調節發酵培養基的初始pH至指定值，探究了初始pH對發酵過程中菌體的生長量以及發酵酶活的影響，選擇了pH為5、6、7、8、9、10、11的7組發酵培養基進行發酵培養，培養結束后進行靜息細胞反應測定酶活，同時測定菌體生長量，實驗結果如圖10。

圖10 發酵培養基初始pH值對發酵產XDH的影響Fig.10 Effect of initial pH of fermentation medium on the production of XDH

由圖10可知，隨著發酵液初始pH的增大，發酵細胞酶活和菌體生長量的趨勢近乎相同，先增加后迅速降低；堿性較強的環境中，發酵酶活和菌體生長量急劇下降，可能是強堿性環境嚴重影響了枯草芽孢桿菌的正常生長代謝。因此，選擇峰值處，即pH 8.0為最適發酵培養的初始pH。

2.2.3 發酵培養基裝液量

培養基的裝液量主要影響的是培養基中的溶氧量，裝液量越大，液體培養基中的氧氣含量越小，由于枯草芽孢桿菌是需氧型微生物，因此裝液量一定程度上會影響枯草芽孢桿菌的呼吸，從而影響生長代謝。本實驗選擇了裝液量10、20、30、40、50 mL進行比較，培養結束后進行靜息細胞反應測定酶活，同時測定菌體生長量選擇最適裝液量，結果如圖11。

圖11 裝液量對發酵產XDH的影響Fig.11 Effect of work volume on the production of XDH

由圖11可知，首先，絕對酶活和菌體生長量分別都隨著裝液量的增大先增長后下降，絕對酶活在裝液量40 mL后開始出現下降的趨勢，而菌體生長量在20 mL后就開始下降，可能是液體溶氧量降低無法滿足枯草芽孢桿菌的增值。綜上，選擇裝液量40 mL為最適裝液量。

2.2.4 發酵培養基接種量

接種量主要影響微生物生長周期中的遲緩期的長短，適宜的接種量可以使發酵周期縮短，從而提高發酵產酶效率[24]。種子培養基中活化培養12 h后，分別以裝液量體積的0.3、0.5、1、2、3、4、5和6 mL/30 mL的接種量接種進行發酵培養。培養結束后進行靜息細胞反應測定酶活，同時測定菌體生長量選擇最適接種量，結果如圖12。

圖12 30 mL裝液體積下接種量對發酵產XDH的影響Fig.12 Effect of inoculation quantity on the production of XDH

由圖12可知，菌體生長量隨著接種量的增大先增加后減少；小于3 mL/30 mL時，相對菌體生長量隨著接種量的增大而緩慢增大；大于3 mL/30 mL時，隨著接種量的增大而減少。此外，發酵酶活隨著接種量的增大呈現先增大后減小的趨勢，以接種量1 mL為基準，可以發現接種量為0.5 mL/30 mL時，酶活達到峰值；其中，接種量大于0.5 mL/30 mL時，酶活先呈現快速下降的趨勢，后趨于平緩。因此選擇接種量為0.5 mL/30 mL為最適接種量。

2.3 靜息細胞反應條件的影響

2.3.1 底物質量濃度

反應體系底物為木糖醇，分別以甘氨酸-NaOH溶液配制質量濃度為5、10、20、50和100 g/L的木糖醇溶液，加入菌體后，于37 ℃水浴3 h，再通過半胱氨酸咔唑酒精法測定產物L-木酮糖的濃度，從而反映不同底物濃度條件下產物產量的差異，結果如圖13。

圖13 反應底物濃度對木酮糖產量的影響Fig.13 Effect of substrate concentration on yield ofL-xylulose

反應體系菌體含量均為1 mL基礎發酵培養基，即細胞含量基本相同，從圖13可以看出，隨著底物質量濃度的增加，產物產量呈現先增加后減少的趨勢。底物質量濃度小于30 g/L時，細胞與底物的結合逐漸飽和，產量呈現逐漸增長的趨勢；底物質量濃度大于30 g/L時，細胞與底物的結合已經飽和，產量降低。因此，選擇底物質量濃度30 g/L為靜息細胞反應的最適底物濃度。

2.3.2 反應溫度

酶參與的催化反應常常對反應溫度非常敏感，溫度過高或過低會導致酶活顯著下降，甚至失活。取反應溫度為25、30、35、37、40、45和50 ℃，水浴3 h后通過半胱氨酸咔唑酒精法測定產量，結果如圖14。

從圖14可以看出，溫度對L-木酮糖的生成有很大的影響。隨著溫度的升高，產量呈現出先增大后減小的趨勢。溫度低于45 ℃時，溫度升高，反應速率加快，底物轉化量逐漸增大；而溫度高于45 ℃后，可能引起酶的部分變性，導致產量下降。綜上，選擇45 ℃為最適靜息細胞反應溫度。

圖14 反應溫度對木酮糖產量的影響Fig.14 Effect of reaction temperature on yield ofL-xylulose

2.3.3 緩沖溶液pH值

靜息細胞反應過程中需要緩沖溶液來維持體系的pH值的穩定性，本實驗選擇pH值為9.0、10.0、11.0的甘氨酸-NaOH緩沖溶液和pH為7.0、8.0、9.0的Tris-HCl緩沖溶液分別配制底物質量濃度為20 g/L的反應體系進行靜息細胞反應，測定產物質量濃度，結果如圖15。

圖15 反應緩沖體系對產物產量的影響Fig.15 Effect of buffer system on yield of L-xylulose

由圖15可以看出，用Tris-HCl緩沖溶液所配制的反應體系的L-木酮糖的產量都低于甘氨酸-NaOH緩沖溶液所配制的反應體系的產量，其中緩沖溶液為pH為10.0的甘氨酸-NaOH緩沖溶液時，產物產量最高，pH低于或高于10.0都呈下降趨勢。因此，選擇pH為10.0的甘氨酸-NaOH緩沖溶液為最適反應緩沖溶液。

3 結論

含Pantoeaananatis來源的4-木糖醇脫氫酶基因的質粒型枯草芽孢桿菌工程菌進行發酵的條件：最優培養基配方(g/L)：蔗糖25，尿素6，MgSO40.05，MnSO40.01，FeSO40.01；最優發酵條件：初始pH 8.0，裝液量為40 mL，接種量為1.67%，發酵溫度為28 ℃。通過靜息細胞反應得到最優的反應條件：底物質量濃度20 g/L，緩沖溶液為甘氨酸-NaOH溶液(pH 10.0)，反應溫度為45 ℃。以上條件下得到的最終酶活為5.183 U/L，與LB培養基相比提高231.2%，轉化率達17.74%。先前報道的1株可氧化木糖醇轉化生產L-木酮糖的菌株ZN-14，利用該菌株的靜息細胞以木糖醇溶液(20 g/L，pH 9.0)為底物在37 ℃轉化24 h，轉化率達26.62%。

雖然本研究中枯草芽孢桿菌的轉化率不及巨大芽孢桿菌，但是這株枯草芽孢桿菌為食品級微生物，且在工業上應用廣泛，且使用枯草芽孢桿菌靜息細胞轉化生產L-木酮糖未見相關研究。通過對重組枯草芽孢桿菌生產L-木酮糖發酵條件的優化及靜息細胞轉化木糖醇工藝的研究，為更進一步研究生物轉化法制備L-木酮糖提供新材料，這對稀有糖的研究開發具有重要意義。和化學法合成L-木酮糖相比，靜息細胞轉化法成本低、方法簡單且沒有副產物的干擾，易于實現工業化生產，基于長遠考慮，生物轉化法是最具潛力的，也是L-木酮糖生產技術的主要研究方向。然而，關于這種稀有糖制備的研究報告并不多見，嚴重制約了這種稀有糖的研究與應用，因此進一步提高L-木酮糖的產量是今后研究工作的方向。