二氧化氯對玉米乙醇發酵糟液中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的降解

李曉，方帷，熊粟栗，袁文娟，高婧琪，李華志，張杰*

1(四川大學 生命科學學院,四川 成都，610064) 2(生物資源與生態環境教育部重點實驗室(四川大學)，四川 成都，610064) 3(四川省資中縣銀山鴻展工業有限公司，四川 資中，641200)

真菌毒素是各種霉菌在適宜的溫度、濕度及生長基質上產生的高毒性代謝產物，其中，鐮刀菌、青霉、曲霉是產生霉菌毒素的主要霉菌[1]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，俗稱嘔吐霉素，是最常見的真菌毒素之一，屬于單端孢霉烯族毒素，主要由禾谷鐮刀菌和粉紅鐮刀菌產生[2]。DON感染農作物時會加重作物赤霉病的發病程度，降低糧食的產量和品質[3]；而且具有很強的細胞毒性，即使在DON濃度較低的情況下，長期攝入也會損害人類和動物的健康[4]，如發生厭食、嘔吐、腹瀉、反應遲鈍、神經障礙等多種癥狀[5-7]，嚴重時還可能使造血系統受到損害從而造成死亡[8]。

DON在全世界范圍內對糧食的污染都很普遍，特別是在中國、美國、阿根廷等糧食生產區的污染情況更為突出，有的地區其檢出含量最高者可達6.496 mg/kg[9]。中國政府規定面粉、大米、玉米等食品中DON的最高限量為1 mg/kg，動物飼料中DON最高限量為5 mg/kg。該毒素是造成糧食污染的重要原因之一，并逐步蔓延至乙醇發酵工業，被污染的糧食谷物經發酵、蒸餾后，大量DON聚集濃縮在發酵糟液中，嚴重影響了發酵副產品酒糟蛋白飼料(distillers dried grains with soluble，DDGS)的品質[10]。DDGS是一種高營養價值的動物飼料，積累在DDGS中的毒素可通過食物鏈傳遞，最終影響動物和人類的健康，因此尋找一種經濟有效的DON脫毒方法十分必要。用紫外光照射[11]、臭氧降解[12-13]、微波處理[14]、加壓加熱[15-16]等方式對DON進行處理，或使用從自然界中篩選的DON降解菌進行生物降解[17]，均取得了一定的進展。

ClO2是國際公認的安全、無毒的綠色消毒劑，具有強氧化性及廣譜殺菌效力，且不會對環境造成二次污染，無“三致效應”(致癌、致畸、致突變)[18]，被廣泛地應用于自來水消毒[19-20]、食品保鮮[21]、面粉和紙漿的漂白、醫療滅菌[22]等方面。現已有研究顯示，500 mg/L ClO2對黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮有較好的降解效果[23]，但就ClO2對DON是否具有同樣的降解效果，這方面的研究還很少，本文就ClO2對DON純品及玉米乙醇發酵糟液中的DON的降解效果作了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

經發酵蒸餾后的玉米乙醇發酵糟液，取樣于四川省資陽市銀山鴻展工業有限責任公司酒廠；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準品，美國Sigma公司；色譜甲醇、乙腈，成都蜀都有限公司；ClO2粉末(純度>98%)，北京湘怡源生環保科技有限公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜系統(Waters 1525-2998PDA)，美國Waters科技有限有公司；質譜儀(TSQ Quantum Ultra)，賽默飛世紀爾科技有限公司；高速臺式冷凍離心機(Centrifuge 5804R)，艾本德(Eppendorf)科技有限公司；超聲波清洗儀(PS-20)，潔康有限公司；Oasis HLB固相萃取柱，沃特世科技(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DON標準儲備液及工作液的制備

標準儲備液：精確稱量5.0 mg的DON標準品于5 mL容量瓶中，色譜甲醇溶解，定容后配制成1.0 mg/mL的DON標準儲備液，于0～4 ℃冷藏備用。

標準工作液：將DON標準儲備液用超純水稀釋為質量濃度0.10、0.20、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00 μg/mL的標準工作液，現配現用。

1.3.2 不同質量濃度ClO2對DON純品的影響

準確稱取25.0 g ClO2粉末于1 L容量瓶中，用超純水溶解，定容，配制成2 000.0 mg/L的ClO2濃溶液，避光密封保存，備用。

將ClO2濃溶液用超純水稀釋為質量濃度為50.0、100.0、150.0、300.0、600.0、900.0、1 200.0、1 500.0 mg/L的ClO2處理液，并向其中添加DON純品，使DON的終濃度為5 μg/mL。室溫下避光靜置處理，并于12、24、36和48 h分別取樣檢測DON的含量。

1.3.3 ClO2對玉米乙醇發酵糟液中DON的影響

準確稱取5.0 g玉米乙醇發酵糟液，向其中加入5 mL質量濃度50.0、100.0、150.0、300.0、600.0 mg/L的ClO2溶液，室溫下避光處理12 h。

12 h處理后，加入20 mLV(乙腈)∶V(水)=84∶16提取液，40 ℃恒溫下超聲提取30 min，8 000 r/min離心5 min，取6 mL上清液于Oasis HLB小柱上樣過濾(小柱提前用3 mL甲醇和3 mL去離子水預活化)，過濾后用3 mL去離子水淋洗柱，空氣抽干小柱，2 mL甲醇洗脫，45 ℃氮氣吹干，用1 mL色譜甲醇復溶，經0.22 μm有機濾膜過濾后進樣檢測。

1.3.4 pH值對DON純品降解的影響

使用pH計對玉米乙醇發酵糟液以及600.0 mg/L ClO2溶液的pH值進行測定。根據pH值測定結果，將600.0 mg/L的ClO2溶液pH值用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH溶液分別調節至3.5、4.5、5.5、6.5、7.5，并向其中添加DON純品，使DON的終濃度為5 μg/mL。室溫下處理12 h，取樣檢測DON含量。

1.3.5 DON含量的檢測

HPLC條件[24]：色譜柱：Waters C18column(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相：V(乙腈)∶V(水)=10∶90；柱溫：30 ℃；紫外檢測波長：218 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL。

質譜條件：掃描模式：負離子場掃描；離子源：電噴霧離子源(ESI)；離子源溫度：500 ℃；電噴霧電壓：4 500 V；霧化氣壓力：0.28 MPa；氣簾氣壓力：0.21 MPa；輔助氣壓力：0.28 MPa；掃描范圍：m/z100～600。

1.3.6 統計分析

對于每組處理，均設置3個平行實驗，將來自獨立重復實驗的數據組合并通過平均值±標準偏差計算。使用SPSS軟件通過方差分析(ANOVA)和Duncan的多范圍檢驗(P<0.05)分析所有數據。

2 結果與分析

根據標準工作液HPLC檢測結果，DON的保留時間為15 min左右，以DON進樣濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，得到回歸方程為Y=18 835x-5 291.1，R2=0.999 9，在0.1～20.0 μg/mL范圍類線性關系良好(圖1)。

圖1 ClO2處理前后的DON純品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of DON pure product before and after ClO2 treatment

2.1 ClO2對DON純品的影響

用不同濃度ClO2溶液對DON純品進行處理，DON的降解率隨ClO2濃度的提高以及處理時間的延長而提高。如圖1-a所示，在處理時間為12 h的條件下，50 mg/L ClO2溶液處理DON純品，降解率只有2.37%，當ClO2溶液濃度為150 mg/L時，降解曲線斜率最大，降解率增長速度最快，之后逐漸減小，當ClO2溶液質量濃度達到600 mg/L時，降解率為28.23%，當ClO2溶液濃度達到1500 mg/L時，降解率僅為31.97%，降解率增長幅度較小，說明降解曲線逐步趨向平穩，降解率提升緩慢。如圖1-b所示，ClO2溶液為質量濃度600 mg/L，處理12 h后降解率為28.23%，處理48 h后降解率提升至38.51%，說明延長時間可以在一定程度上增強對DON的降解效果，但與通過提高ClO2濃度來提高降解率相比，延長時間的效果提升不太明顯。因此，綜合經濟效益及降解效果來看，確定最佳ClO2溶液質量濃度為600 mg/L，處理時間為12 h。

a-處理12 h后不同濃度ClO2對DON的降解;b-不同濃度ClO2在不同處理時間下對DON的降解圖2 不同處理對DON降解的影響Fig.2 Different treatments on DON

2.2 ClO2對玉米乙醇發酵糟液的影響

由于ClO2的氧化性較強，為了防止過高濃度ClO2溶液以及過長的處理時間影響玉米乙醇發酵糟液的營養成分，結合ClO2對DON純品的降解效果，選取質量濃度50.0、100.0、150.0、300.0、600.0 mg/L的ClO2溶液對玉米乙醇發酵糟液處理12 h。結果如圖3所示，隨著ClO2質量濃度的增加，玉米乙醇發酵糟液中DON的降解率逐步提升，當ClO2濃度為100 mg/L時，降解曲線斜率最大；600.0 mg/L的ClO2溶液對其處理12 h后，玉米乙醇發酵糟液中DON含量由13.013 μg/mL降低至7.167 μg/mL，降解率達40.70%，降解效果較好。說明該方法能在一定程度上去除玉米乙醇發酵糟液中的DON。

圖3 不同質量濃度ClO2對玉米發酵糟液中DON處理12 h的降解效果Fig.3 Degradation effect of DON in wet corn distillersgrains by different concentrations of ClO2 for 12 h注：不同字母表示不同處理組差異顯著(P <0.05)。下同。

2.3 pH值對DON純品降解的影響

根據pH值測定結果顯示，600 mg/L ClO2溶液pH值為3.71，而玉米乙醇發酵糟液的pH值為4.82。本文研究了pH值對DON降解的影響實驗，結果如圖4所示，當DON所處環境溶液pH值小于4.5或大于5.5時，降解率偏低；當DON所處環境溶液pH值為4.5～5.5時，降解效果最佳，降解率最高可達36.78%，但仍低于玉米乙醇發酵糟液中40.70%的DON降解率，說明pH值確實對DON的降解有一定的影響，但pH值不是導致ClO2溶液對玉米發酵糟液中DON的降解效果較好的唯一原因。

圖4 pH值對DON純品降解的影響。Fig.4 Degradation effect of pure DON in different pH

2.4 降解產物的初步分析

圖5的HPLC-MS圖譜所示，DON的質荷比為295.17，經600 mg/L ClO2溶液對DON純品處理12 h后，DON的相對豐度降低，并產生了2種質荷比為238.96和380.90的新物質，推測應該是DON的降解產物。一般情況下，氧環鍵的化學性質較為活潑，容易斷鍵開環。YOUNG等[25-26]的研究表明，用強氧化劑O3處理單端孢霉烯族毒素時，O3首先攻擊單端孢霉烯族毒素分子的雙鍵部位，并且此氧化作用的效果與C8位上的基團有很大關系，當C8位是酮基時，所需O3的量更少。ClO2具有與O3分子類似的SP2雜化軌道和“V”型分子構型，其在發揮強氧化作用時，很有可能出現與O3類似的降解情況[27]。如圖5所示，首先ClO2與DON的雙建結構發生反應，形成ClO2-DON中間復合物，最后DON在雙鍵處開環降解。此外，在酸性條件下，強氧化劑可以將環己酮氧化為己二酸[28]，ClO2水溶液、玉米乙醇發酵糟液均顯示為酸性，在強氧化劑ClO2作用下也可能在酮基處開環形成新的降解產物(圖6-d)。

a-降解前；b-降解后圖5 經600 mg/L ClO2處理DON純品的HPLC-MS圖譜分析Fig.5 HPLC-MS analysis of DON treated with 600 mg/L ClO2

3 結論與討論

a-DON分子結構；b-ClO2-DON復合物；c-DON碳碳雙鍵處開環降解產物；d-DON酮基處開環降解產物圖6 ClO2處理DON降解產物分析Fig.6 Analysis of DON degradation products by ClO2 treatment

實驗結果表明，ClO2的確對DON有一定的降解效果，結合ClO2對DON純品以及玉米乙醇發酵糟液的降解情況來看，提高ClO2濃度比延長處理時間的降解效果更佳，ClO2質量濃度為0～600 mg/L時，DON降解率隨ClO2濃度提升而提高，之后降解率提升緩慢并逐步趨于穩定。值得注意的是，處于玉米乙醇發酵糟液的環境下，DON的降解效果也較好，推測是玉米乙醇發酵糟液中某種條件促使DON的化學鍵處于活潑狀態，使其容易開環降解，實驗結果表明，當DON所處環境pH值為4.5～5.5時，降解率最高，YOUNG[26]的研究表明，當pH值為4～6時，O3對DON氧化效果更好；常曉嬌等[23]的研究也顯示，pH 7的中性樣品中ZEN的降解情況優于pH 3的酸性樣品。此外，玉米乙醇發酵糟液中可能含有更活潑的電子接受者，能及時與斷開的鍵結合，防止斷開的鍵復原，以提高降解效果。本文為大規模去除DON提供了一種新的思路，但目前僅ClO2對DON的降解做了初步研究，其中的降解原理以及降解產物的具體結構，還有待進一步研究。此外，二氧化氯具有廣泛的氧化作用，可能會降低玉米乙醇發酵糟液中的營養，因此將該DON去毒方法應用到實際中還需要一段時間。