脫氮副球菌DYTN-1高效去除污水中的總氮

盧偉強，毛銀，李國輝，鄧禹*，趙運英*

1(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

在傳統方法中，一般是利用硝化細菌和反硝化細菌[9]來去除污水中的氮。硝化細菌可在有氧條件下將氨氧化成亞硝酸鹽或硝酸鹽，但是生長速度緩慢。而大多數反硝化細菌是異養厭氧菌，以亞硝酸鹽或硝酸鹽為電子受體并生成氮氣[3]，因此傳統方法去除氮對設備要求較高，所用時間較長。而脫氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)具有異養硝化和好氧反硝化一體的特點，具有很好的脫氮能力[10]。為了有效利用資源，通常對細胞進行固定化和回收利用[11]。例如SANJEEVKUMAR使用固定化細胞去除N,N-二甲基甲酰胺(DMF)[12]，這些土壤微生物的巨大潛力已被強化用于去除到培養瓶中的DMF[13]，在合適的基質中截留的細菌細胞已被證明能提高對多種有毒和頑抗性化合物的耐受性[14]。固定化細胞可以通過更高的細胞載量維持去除速率，易于生物過程維持[12]。因此，固定化細胞可作為生物修復環境的一種較好的選擇[15]。由于這些明顯的優點，固定化細胞已被用于去除水體中的許多污染物[16-17]，固定化細胞還被用于食品工業[18]，生物轉化[19]，生物乙醇生產[20]和微生物凈化水體[21]。

本研究探究了海藻酸鈉(sodium alginate，SA)與幾種不同的二價金屬陽離子絡合形成的水凝膠在污水處理中的效果。通過正交試驗確定固定化條件，并測定了固定化細胞使用的循環次數，最終目的是加快P.denitrificans在廢水處理中的推廣和應用，特別是對含氮量較高的廢水的處理。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養基

脫氮副球菌P.denitrificansDYTN-1(菌種編號CCTCC 2016741)來自中國典型培養物保藏中心。富集培養基(g/L)：NaCl 10.0，蛋白胨10.0，酵母提取物5.0。模擬污水培養基(g/L)[22]: KNO30.25，(NH4)2SO40.154，NaNO20.16，KH2PO40.05，K2HPO40.05，NaCl 3.0，C6H12O62.5,微量元素溶液1 mL/L。微量元素溶液(g/L)：MgSO4·7H2O 10.0，ZnSO4·7H2O 2.2，CaCl2·2H2O 7.3，MnCl2·4H2O 2.5，CoCl2·6H2O 0.5，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.5，FeSO4·7H2O 5.0，CuSO4·5H2O 0.2，EDTA-2Na 20.0。模擬污水培養基pH值調節至7.0。

1.2 脫氮副球菌DYTN-1的富集

脫氮副球菌DYTN-1在富集培養基中進行富集[23]，并且當游離細胞的OD600nm=4.0時對細胞進行固定化。7 500 r/min離心10 min，收集菌體，并用磷酸緩沖液洗滌2次供下一步使用[12]。

1.3 固定化脫氮副球菌DYTN-1

采用海藻酸鈉對細胞DYTN-1進行固定化，用磁力攪拌器將一定濃度的海藻酸鈉與離心后的菌體混合均勻。使用注射式造粒機將上述混合物滴落至二價金屬陽離子的溶液中，置于2～4 ℃環境中交聯3～5 h以形成珠粒(直徑為3～4 mm)。形成的珠粒用無菌水洗滌3～5次，置于4 ℃冰箱中供下一步使用。將固定化后的細胞放入污水中，測定固定化細胞是否對污水中的總氮具有去除效果。如果對污水中的總氮沒有去除效果，則說明固定化細胞已經失活。

1.4 測定方法

采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法[24]測定TN。以TN含量(mg/L)為橫坐標，對應的Ar值為縱坐標，繪制校準曲線。

Ab=Ab220-2Ab275

(1)

As=As220-2As275

(2)

Ar=As-Ab

(3)

式中：Ab,零濃度(空白)溶液的校正吸光度；Ab220,零濃度(空白)溶液于波長220 nm處的吸光度；Ab275,零濃度(空白)溶液于波長275 nm處的吸光度；As，標準溶液的校正吸光度;As220，標準溶液于波長220 nm處的吸光度；As275，標準溶液于波長275 nm處的吸光度；Ar，標準溶液校正吸光度與零濃度(空白)溶液校正吸光度的差。

配制硝酸鉀標準使用液，按照堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法[24]測定TN，并繪制標準曲線，如圖1所示。

圖1 TN標準曲線Fig.1 TN standard curve

由圖1可以看出，所得的標準曲線R2=0.999 3，因此可以進行TN的測定。

1.5 設計正交試驗

為了找到固定化細胞去除廢水中總氮的最佳條件，設計正交試驗來研究以下4個因素對固定化細胞的影響：海藻酸鈉濃度，海藻酸鈉與菌株的比例，交聯劑的濃度和固定的時間。

2 結果與分析

2.1 游離狀態下脫氮副球菌DYTN-1去除工業污水中的總氮

為了研究游離狀態下脫氮副球菌DYTN-1對去除污水中總氮的影響，分別設置DYTN-1的接種量為1%、2%、3%和4%，置于30 ℃，200 r/min的條件下培養。按照國家標準方法[24]測定污水中總氮的含量，實驗結果表明，總氮的去除效果與脫氮副球菌DYTN-1的接種量呈顯著的正相關。接種量為1%～2%需48 h才能將總氮含量降低至國家排放標準[25](圖2-a和圖2-b)。但當接種量為3%～4%時，污水中的總氮在24 h內總氮含量達到國家排放標準，總氮含量在接下來的48 h內變化不大(圖2-c和圖2-d)。基于以上研究可以看出，脫氮副球菌DYTN-1在處理廢水方面具有很大的潛力。為了能夠有效循環利用脫氮副球菌DYTN-1，采用細胞固定化技術對DYTN-1進行固定化。

2.2 不同二價金屬離子與海藻酸鈉交聯對固定化細胞去除污水中總氮的影響

海藻酸鈉是從褐藻類的海帶或馬尾藻中提取碘和甘露醇之后的副產物，其分子由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronic，M)和α-L-古洛糖醛酸(α-L-guluronic，G)按(1→4)鍵連接而成，是固定化細胞的理想載體，對微生物無毒性[26]。

2.2.1 測試不同的二價金屬離子作為交聯劑對固定化細胞的影響

(a)至(d)-DYTN-1的接種量分別為1%，2%，3%和4%圖2 不同接種量的DYTN-1對去除污水中總氮的影響Fig.2 Effect of different inoculation amount of DYTN-1 on removal TN from wastewater

分別采用Ca2+、Zn2+、Ba2+、Cu2+、Co2+和Mg2+作為交聯劑，研究上述6種二價金屬離子與海藻酸鈉交聯生成的水凝膠是否具有細胞活性(表1)。發現Mg2+作為交聯劑不能形成水凝膠，而Zn2+、Cu2+和Co2+分別作為交聯劑能夠形成水凝膠，但沒有細胞活性。只有以Ca2+和Ba2+為交聯劑形成的水凝膠具有細胞活性，能有效去除廢水中的總氮。

表1 不同二價金屬陽離子作為交聯劑的比較Table 1 Different two valence cations are used ascrosslinking agents

注：+:形成的水凝膠具有細胞活性；-:形成的水凝膠無細胞活性；*:未能形成水凝膠

2.2.2 測定具有活性的固定化細胞對污水中總氮的去除效果

使用2種不同的二價金屬陽離子Ca2+和Ba2+作為交聯劑，并測定了固定化細胞去除廢水中總氮的效果。發現固定化細胞的去除效率比游離細胞的去除效率更高，使用Ca2+、Ba2+作為交聯劑，所形成的水凝膠能夠分別在4、8 h內將廢水中的總氮含量降低至10 mg/L以下(圖3)。

2.3 固定化脫氮副球菌DYTN-1去除污水中總氮的最佳條件

2.3.1 兩種不同交聯劑形成水凝膠循環使用的次數

為了測定2種不同交聯劑形成的水凝膠的循環使用次數，分別將Ca2+、Ba2+作為交聯劑形成的水凝膠放入模擬的污水培養基中，并測定使得污水中的總氮含量達到國家排放標準時重復使用的次數。將上述2種水凝膠放入模擬的污水中，當污水中總氮含量達到國家排放標準時，用紗布將水凝膠截留下來，并注入新的污水，直至水凝膠破裂，對這2種交聯劑形成的水凝膠循環使用的次數進行確認。結果表明，Ba2+作為交聯劑形成水凝膠的使用次數為9次，明顯高于Ca2+(5次)。

2.3.2 固定化脫氮副球菌DYTN-1去除污水中總氮的最佳條件

設計正交實驗來考察海藻酸鈉濃度，海藻酸鈉與菌株的比例，交聯劑的濃度以及固定化時間對固定化細胞的影響。結果表明，不同條件下形成的水凝膠在去除效率上存在顯著差異。在實驗1、實驗4和實驗8中(表2)，總氮去除率均高于80%。實驗8的去除效果顯著，去除率為87.6%，而實驗9則沒有明顯的去除效果，去除率幾乎為零。因此，不同條件下形成的水凝膠對去除污水中總氮的影響很大。由表2可以看出，各因素影響的主次為SA與菌種比例>固定化時間>氯化鋇濃度>SA含量，通過效應曲線(圖4)，得到最佳的實驗條件：SA含量為3%，SA與菌種比例為1∶1，氯化鋇濃度為0.1 mol/L，固定化時間為5 h。

a-鈣離子作為交聯劑；b-鋇離子作為交聯劑圖3 不同二價金屬離子交聯對固定化細胞去除廢水中總氮的影響Fig.3 Effect of cross-linking of different divalent metal ions on removal TN from wastewater by immobilized cells

表2 正交實驗測定結果Table 2 The content and determination results oforthogonal test

注： *，實驗2中,由于海藻酸鈉與菌種濃度過低未能形成水凝膠，因此設定其去除率為0

圖4 固定化DYTN-1細胞最佳條件的效應曲線Fig.4 The effective curve of the optimum conditions forimmobilization DYTN-1 cells

為了驗證正交實驗結果，在上述最佳的條件下對脫氮副球菌進行了固定化，并測定了固定化細胞去除污水中總氮的效果。從第3批污水開始，固定化的脫氮副球菌DYTN-1細胞可在3 h內將廢水中總氮的濃度降低至20 mg/L以下(圖5)。第1批廢水中總氮含量達到國家排放標準需要8 h。第2批次總氮的去除速度明顯加快，運行至第4 h時總氮含量已低于20 mg/L。在處理第3批污水時，總氮含量在2.5 h后達到標準，比第2批縮短37.5%，比第1批縮短68.75%。到第4批時，污水中總氮達到國家排放標準所需時間為2 h，比第一批所用的時間縮短了6 h。處理第5批污水時，僅1 h時內污水中總氮含量已經低于20 mg/L。在后面的批次中，基本在1 h內使得污水中總氮含量達到排放標準，由于固定化細胞可以通過更高的細胞載量維持去除速率，易于生物過程維持，固定化后形成的水凝膠里面的細胞數量不斷增加，對污水的總氮利用效率不斷提高，所用的時間不斷減少。在最佳條件下固定化細胞能夠循環使用12次，與在一般條件下固定化的細胞(9次)相比，循環次數增加了33.3%。

3 結論

本研究確定了1株可用于去除污水中總氮的脫氮副球菌DYTN-1。為了進一步提高脫氮副球菌DYTN-1對污水中總氮的去除效率，以海藻酸鈉為載體，以Ba2+為交聯劑對脫氮副球菌DYTN-1進行細胞固定化。固定化的最佳條件為:SA含量為3%，SA與菌種比例為1∶1，BaCl2濃度為0.1 mol/L，固定化時間為5 h。結果表明，固定化細胞能夠明顯提高廢水中總氮的去除效率，顯著降低運行周期，而且固定化后的細胞可多次重復使用。因此，本研究為去除廢水中的總氮提供了一種經濟有效的方法。

圖5 固定化細胞在最佳條件下去除污水中的總氮Fig.5 Immobilized cells remove TN from wastewater under optimal conditions. Error bars represents the standard deviations注：圖中數字表示循環次數