蛋氨酸、半胱氨酸及蘇氨酸對啤酒酵母產二氧化硫和乙醛的影響

毛江川，王金晶，鄭飛云，劉春鳳，鈕成拓，李崎*

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122) 2(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

啤酒老化是啤酒行業亟待解決的問題，不僅對啤酒風味及風味穩定性產生嚴重的不利影響，還降低啤酒的新鮮度和縮短其貨架期。風味穩定性是評價啤酒質量的重要指標之一，其中SO2是啤酒中最有效的風味穩定劑和抗氧化劑之一，通過與H2O2反應清除啤酒中的氧自由基，從而有效提高啤酒抗氧化能力[1-3]。乙醛是啤酒中含量最高的羰基化合物，與啤酒老化直接相關[4]，其形成過程與酵母的能量代謝密切相關。過高的乙醛含量給啤酒帶來生青味和腐爛蘋果味等不良風味，同時影響啤酒的風味穩定性。

與硫代謝相關的蛋氨酸、半胱氨酸和蘇氨酸對啤酒酵母產SO2存在一定的影響，而對乙醛產量的影響報道甚少。為探究啤酒酵母中總SO2和乙醛產量的影響因素及兩者產量之間的關系，本研究將這3種氨基酸添加于麥汁中，分析其對啤酒酵母總SO2和乙醛產量的變化情況，同時利用BiWort和BiGGY平板來定性分析3種氨基酸引起啤酒酵母SO2產量變化的原因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與培養基

YEPD培養基(g/L)：酵母浸出粉10，蛋白胨20，無水葡萄糖20，115 ℃下滅菌15 min。

BiGGY培養基(g/L)：酵母浸出粉1，甘氨酸10，無水葡萄糖20，Na2SO31，檸檬酸鉍銨1，瓊脂粉16，115 ℃下滅菌15 min。

麥汁培養基：12 °P自制麥汁，105 ℃下滅菌10 min。

BiWort培養基(g/L)：12 °P自制麥汁，檸檬酸鉍銨1，瓊脂粉16，105 ℃下滅菌10 min。

1.1.2 試劑

酵母浸出粉、蛋白胨、瓊脂粉，生工生物工程(上海)股份有限公司；無水葡萄糖、甘氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、亞硫酸鈉，國藥集團化學試劑有限公司；檸檬酸鉍銨、乙醛(色譜純)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；3-庚酮(色譜純)，Sigma-Aldrich公司；麥芽，中糧集團有限公司。

1.2 儀器與設備

阿貝折光儀，上海豫光儀器有限公司；紫外可見分光光度計(UV-2000)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；高壓滅菌鍋(HVE-50)，日本Hirayama公司；自動頂空進樣氣相色譜儀(GC-2010)，日本島津(Shimadzu)公司；臺式冷凍離心機(5804 R)，德國Eppendorf公司；生化培養箱(SPX-250)，上海躍進醫療器械有限公司；生化培養箱(BSP-250)，上海博訊實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 啤酒發酵實驗

挑取一環啤酒酵母菌株于10 mL 12 °P麥汁試管中，28 ℃培養36 h后轉接1 mL菌液于9 mL 12 °P麥汁試管中，25 ℃培養36 h后轉接入70 mL 12 °P麥汁，23 ℃培養48 h后轉接入300 mL 12 °P麥汁，接種量為1×107CFU/mL。搖勻后扣上發酵栓，用無菌水密封發酵栓后11 ℃發酵7 d。為研究蛋氨酸、半胱氨酸和蘇氨酸對啤酒酵母總SO2和乙醛產量的影響，在麥汁中分別添加質量濃度為100 mg/L和200 mg/L三種氨基酸。

1.3.2 鹽酸副玫瑰苯胺法測定發酵液中總SO2含量

參照文獻[19]中鹽酸副玫瑰苯胺法測定發酵液中總SO2含量。將發酵液在5 000×g離心5 min后取上清液，上清液中SO2與5%甲醛和鹽酸副玫瑰苯胺發生反應產生紫色絡合物，在550 nm波長處檢測其吸光值，其總SO2的標準曲線方程為y=0.028 88x-0.007 23 (R2=0.999 2)。

1.3.3 頂空氣相色譜法測定發酵液中乙醛含量

將發酵液離心后取上清，參照文獻[20]中方法進行發酵液中乙醛的檢測。分別添加4 mL發酵液、1 mL 30 mg/L 3-庚酮內標和1.8 g NaCl于頂空瓶。檢測條件為：FID檢測器溫度為250 ℃；色譜柱由初始溫度40 ℃以10 ℃/min升至180 ℃。

1.3.4 比重瓶法測定發酵液中乙醇含量

取經濾紙過濾后的發酵液100 mL，并加入50 mL去離子水于圓底燒瓶進行蒸餾，將100 mL餾出物進行比重瓶法測定，計算比值后查閱GB/T 4928—2008啤酒分析方法，其對應值為發酵液中乙醇體積分數(φ)。

2 結果與分析

2.1 啤酒酵母中總SO2和乙醛產量的關系

表1 典型啤酒酵母菌株中總SO2和乙醛產量Table 1 The production of total SO2 and acetaldehydein brewer’s yeasts

注：同一行不同字母代表顯著性差異(P<0.05)。

加黑代表啤酒酵母菌株中表達上調，淺色代表啤酒酵母菌株中表達下調圖1 啤酒酵母中含硫氨基酸和乙醛代謝圖Fig.1 Sulfur amino acid and acetaldehyde metabolism in brewer’s yeast

2.2 硫代謝關鍵氨基酸對啤酒酵母總SO2和乙醛產量的影響

2.2.1 外源蛋氨酸對啤酒酵母總SO2和乙醛產量的影響

表2 外源添加蛋氨酸對啤酒酵母產總SO2、乙醛和乙醇的影響Table 2 Effects of methionine on total SO2, acetaldehyde and ethanol production in brewer’s yeasts D-A-14 and

注：同一列不同字母代表顯著性差異(P<0.05)。

圖2 蛋氨酸對啤酒酵母D-A-14和中還原酶活性和S2-產量的作用Fig.2 Effects of methionine on sulfite reductase activityand sulfide production in brewer’s yeasts D-A-14 and

2.2.2 外源半胱氨酸對啤酒酵母總SO2和乙醛產量的影響

表3 外源添加半胱氨酸對啤酒酵母產總SO2、乙醛和乙醇的影響Table 3 Effects of cysteine on in total SO2, acetaldehyde and ethanol production in brewer’s yeasts D-A-14 and

注：同一列不同字母代表顯著性差異(P<0.05)。

圖3 半胱氨酸對啤酒酵母D-A-14和中還原酶活性和S2-產量的作用Fig.3 Effects of cysteine on sulfite reductase activity and sulfide production in brewer’s yeasts D-A-14 and

2.2.3 外源蘇氨酸對啤酒酵母總SO2和乙醛產量的影響

表4 外源添加蘇氨酸對啤酒酵母產總SO2、乙醛和乙醇的影響Table 4 Effects of threonine on total SO2, acetaldehyde and ethanol production in brewer’s yeasts D-A-14 and

注：同一列不同字母代表顯著性差異(P<0.05)。

圖4 蘇氨酸對啤酒酵母D-A-14和中還原酶活性和S2-產量的作用Fig.4 Effects of threonine on sulfite reductase activity and sulfide production in brewer’s yeasts D-A-14 and

2.3 啤酒酵母中總SO2和乙醛產量的相關性

圖5 啤酒酵母中添加3種氨基酸后總SO2和乙醛產量的相關性分析Fig.5 Correlation analysis between total SO2 andacetaldehyde production by addition of three amino acids in brewer’s yeast

3 結論