新型余甘子酵素發酵工藝的優化

蘇春雷，王強,2，黃潔君，王啟軍,5*

1(華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州，510640) 2(中新國際聯合研究院，廣東 廣州，511363) 3(廣東揭陽中健食品科技有限公司，廣東 揭陽，515535) 4(廣東成燁泰生物科技有限公司，廣東 珠海，519080) 5(華南理工大學，現代食品工程研究中心，廣東 廣州，510006)

余甘子又名油柑子、滇橄欖、魚木果等[1]，廣泛分布于(亞)熱帶，在中國主要分布于云南、福建、廣東、廣西和海南等幾個省區[2-3]。余甘子性涼，味甘、酸、苦、澀，含有多種有益成分，如多酚類、氨基酸類、維生素類和微量礦物元素等[4-5]。研究表明，余甘子果肉中含有豐富的酚類物質，含量可達到11.4%[5-6]，并且其VC含量在水果中僅次于刺梨[7]。余甘子是聯合國衛生組織指定的在世界范圍內推廣種植的3種保健植物之一，在1998年被國家衛生部列入首批藥食兼用名單[3-4,8]，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、降血脂、抗腫瘤、抗誘變突變等生理和藥用功能，且無明顯的毒副作用[9]。

食用酵素是以動物、植物、食用菌等為原料，經微生物發酵制得的含有特定生物活性成分可食用的酵素產品[10]，包含多酚、氨基酸、功效酶、有機酸、維生素、益生菌等有益成分[11]，這些成分為食用酵素提供了抑菌消炎、美容養顏、維持機體平衡、解酒護肝、改善腸胃、提高免疫力等生理功能[12-22]。

本文以余甘子為實驗原料，選取食品發酵常用霉菌作為菌種，采用前發酵加主發酵的兩段發酵法，以游離氨基酸含量和總酚含量為主要指標，結合還原糖含量、蛋白質含量以及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除能力等其他指標，研究1種新型余甘子酵素的發酵工藝，制備品質良好的余甘子酵素飲品，為余甘子鮮果的開發利用提供了新的途徑和科學依據，有助于提高余甘子的經濟及社會價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

余甘子、黃砂糖、麩皮，市售；米根霉、米曲霉、黑曲霉，廣東省微生物菌種保藏中心。

L-亮氨酸、DPPH：色譜純；福林酚，生物試劑；甲基紅、亞甲基藍：指示劑；3,5-二硝基水楊酸，化學純；其他試劑，分析純；高效凱氏定氮催化劑片，北京金元興科科技有限公司。

1.2 主要儀器與設備

SW-CJ-1FD超凈工作臺，蘇州智凈凈化設備有限公司；YX-2800手提式壓力蒸汽滅菌器，合肥華泰醫療設備有限公司；LRH生化培養箱，上海一恒科技有限公司；JW-3024HR高速冷凍離心機，安徽嘉文儀器裝備有限公司；UV-1800紫外分光光度計，Shimadzu Suzhou Instruments Mfg. CO., Ltd；FE20 pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；SH220F石墨消解儀，山東海能科學儀器有限公司；KjeltecTM8100凱氏定氮儀，福斯分析儀器有限公司；PAL-1手持式糖度計，ATAGO Co., Ltd.。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

菌種→活化→制曲 糖水(ω=40%)

↓ ↓

余甘子處理→前發酵→主發酵→過濾離心→上清液巴氏殺菌→余甘子酵素

1.3.2 操作要點

1.3.2.1 原輔料處理

挑選新鮮、無腐爛、無霉變的余甘子，用無菌水洗凈后晾干，去核，破碎成小于5 mm的果塊，整個操作在無菌操作臺內進行。糖水：黃砂糖在紫外下滅菌30 min后用無菌水調配成ω=40%。

1.3.2.2 菌種活化和制曲

菌種活化：按照廣東省微生物菌種保藏中心提供的操作說明活化2代后制成孢子懸浮液備用。

制曲[23-24]：首先將麩皮與水以質量比1∶1混合拌勻并裝入三角瓶中，經0.098 MPa蒸汽滅菌30 min，冷卻至35 ℃左右，加入質量分數1%～2%的孢子懸浮液；然后28～30 ℃保溫培養至長出菌絲，搖瓶；再培養1～2 d，扣瓶，培養12～24 h；最后裝入無菌紙袋，37～40 ℃下干燥至含水量(10±1)%后裝入無菌密閉容器，低溫干燥保存不超過1個月。

1.3.2.3 前發酵

本工藝選取的菌種是食品發酵常用霉菌，均為好氧菌，根據微生物在對數生長期時酶系活躍的特性[25]，為了產生足夠的酶對原輔料進行分解，縮短發酵周期，需要先讓霉菌在合適的溫度和有氧的條件下生長一定時間。調節前發酵的溫度為28 ℃，并用透氣膜包住發酵容器口使空氣流通和隔離環境微生物，保證霉菌的生長。

1.3.2.4 主發酵

為了防止霉菌過量生長消耗營養物質，并讓前發酵產生的各種酶充分作用，把發酵物中的大分子物質水解為易于被吸收利用的生物活性小分子物質，同時改善酵素的氣味、口感等，從而需要在前發酵結束時對霉菌進行抑制并繼續發酵一段時間。按m(原料)∶m(糖水)=1∶1加入質量分數為40%的糖水，使發酵物體積占發酵容器總體積的90%～95%，調節主發酵的溫度為23 ℃，密封發酵。

1.3.3 單因素試驗

在單因素試驗中，先后考察發酵曲種(無曲種、米根霉、米曲霉、黑曲霉、米根霉+米曲霉、米根霉+黑曲霉、米曲霉+黑曲霉、米根霉+米曲霉+黑曲霉)，前發酵時間(0、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h)，主發酵時間(0、15、30、45、60、75、90 d)，黑曲霉曲種添加量(ω=0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%，ω為黑曲霉曲種質量與黑曲霉曲種和余甘子果肉的總質量之比)和米根霉曲種添加量(ω=0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%，ω為米根霉曲種質量與米根霉曲種和余甘子果肉的總質量之比)對余甘子酵素游離氨基酸含量和總酚含量的影響。

1.3.4 響應面優化試驗

在上述單因素試驗結果的基礎上，采用Box-Behnken設計方法[26-28]，選擇前發酵時間、主發酵時間、黑曲霉曲種添加量和米根霉曲種添加量為自變量，以游離氨基酸含量和總酚含量的綜合評分為響應值，設計4因素3水平的響應面試驗，從而獲得最佳的發酵工藝條件。設計的因素水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

通過運用隸屬度綜合評分法和加權計算對所得酵素進行綜合評分[29]，其中隸屬度按公式(1)計算，綜合評分按公式(2)計算：

(1)

式中:Ci，指標值；Cmin，指標最小值；Cmax，指標最大值。

S=aL氮+bL酚

(2)

式中:L氨，游離氨基酸含量隸屬度；L酚，總酚含量隸屬度；a，游離氨基酸含量權重，賦予a=0.5；b，總酚含量權重，賦予b=0.5。

1.3.5 余甘子酵素的理化特性及感官評價

1.3.5.1 游離氨基酸含量

采用茚三酮比色法測定游離氨基酸含量[30]。游離氨基酸含量用亮氨酸等價物表示，亮氨酸標準曲線回歸方程如公式(3)所示：

y=7.236 6x-0.019 7，R2=0.999 1

(3)

1.3.5.2 總酚含量

采用福林酚法測定總酚含量[31-32]，取2.00 mL余甘子酵素，加入1 mL福林酚試劑(1∶5 H2O)，3 min后加入20% Na2CO3溶液2 mL，混合后在30 ℃避光靜置30 min，765 nm處測定吸光度?？偡雍坑脹]食子酸等價物表示，沒食子酸標準曲線回歸方程如式(4)所示：

y=34.149x+0.013 5，R2=0.999 1

(4)

1.3.5.3 其他特性

蛋白質含量：凱氏定氮法[33]。還原糖含量：3,5-二硝基水楊酸法[12]。pH值：pH計直接測定。可溶性固形物：手持式糖度計直接測定。DPPH自由基清除能力：參照管章瑞等[34]的方法測定。羥自由基清除能力：參照蔣增良等[35]的方法測定。

1.3.5.4 感官評價

感官評價小組由10人組成，單獨對余甘子酵素進行觀察、嗅聞和品嘗后，根據表2的感官評價標準進行綜合打分，同一樣品的最終得分為10人總數的平均值。

表2 新型余甘子酵素感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of novelPhyllanthus emblica jiaosu

1.3.6 數據處理

所有試驗均重復3次，結果取平均值。采用SPSS、Origin和Design-Expert軟件進行數據處理分析及繪圖。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 發酵曲種對余甘子酵素游離氨基酸和總酚含量的影響

在固定前發酵36 h、主發酵45 d、各曲種的添加量為質量分數0.75%的條件下，改變發酵曲種，測定主發酵45 d后的余甘子酵素的游離氨基酸和總酚含量，結果見圖1。

圖1 發酵曲種對余甘子酵素游離氨基酸和總酚含量的影響Fig.1 Effect of fermentation strains on free amino acid content and total phenol content of Phyllanthusemblica jiaosu注：圖中同一指標的不同小寫字母表示兩者差異顯著(P<0.05)。下同。

由圖1可知，米根霉+黑曲霉發酵得到的余甘子酵素的游離氨基酸含量最高，為4.16 mg/mL，顯著高于對照組和其他曲種(P<0.05)；在總酚含量上，米根霉+黑曲霉的發酵得到的余甘子酵素最高，為9.27 mg/mL，米曲霉的最低，為7.20 mg/mL，米根霉+黑曲霉發酵得到的余甘子酵素的總酚含量與其他組之間均差異顯著(P<0.05)。因此，米根霉+黑曲霉的發酵效果最好，確定為最佳的發酵曲種。

2.1.2 前發酵時間對余甘子酵素游離氨基酸和總酚含量的影響

在固定發酵曲種為米根霉+黑曲霉、主發酵45 d、各曲種的添加量為質量分數0.75%的條件下，改變前發酵時間，測定主發酵45 d后的余甘子酵素的游離氨基酸和總酚含量，結果見圖2。

圖2 前發酵時間對余甘子酵素游離氨基酸和總酚含量的影響Fig.2 Effect of pre-fermentation time on free amino acid content and total phenol content of Phyllanthusemblica jiaosu

由圖2可知，游離氨基酸含量和總酚含量的變化趨勢均為先上升后下降，余甘子酵素在前發酵為36 h，再經過主發酵45 d后，其中的游離氨基酸含量達到最高值4.16 mg/mL，總酚含量也達到最高值9.27 mg/mL。這可能是因為米根霉和黑曲霉產生了具有破壞植物細胞結構、水解蛋白質和結合態多酚作用的果膠酶、纖維素酶和蛋白酶等，使果實細胞中的游離氨基酸和游離多酚得以釋放，以及水解了蛋白質和結合態多酚，所以兩者的含量均上升；另一方面，可能因為隨著前發酵時間增加，微生物生長過量，對游離氨基酸和總酚的消耗大于生成[36-38]，導致當前發酵超過36 h后，經過45 d主發酵得到的余甘子酵素的游離氨基酸和總酚含量都開始下降。因此最佳前發酵時間為36 h。

2.1.3 主發酵時間對余甘子酵素游離氨基酸和總酚含量的影響

在固定發酵曲種為米根霉+黑曲霉、前發酵36 h、各曲種的添加量為質量分數0.75%的條件下，改變主發酵時間，測定主發酵結束后的余甘子酵素的游離氨基酸和總酚含量，結果見圖3。

圖3 主發酵時間對余甘子酵素游離氨基酸和總酚含量的影響Fig.3 Effect of main fermentation time on free amino acid content and total phenol content of Phyllanthusemblica jiaosu

如圖3所示，在經過36 h前發酵后，隨著主發酵時間增加，余甘子酵素的游離氨基酸和總酚含量顯著上升(P<0.05)，到45 d時最高，分別為4.16 mg/mL和9.27 mg/mL，這可能是因為前發酵所產生的蛋白酶和果膠酶等在主發酵期間繼續對原輔料作用。主發酵時間繼續增加，游離氨基酸和總酚含量變化無顯著性差異，保持在較高的水平，出現此現象的原因可能是45 d后原輔料中的游離氨基酸和多酚已經在酶的作用下被釋放完全。因此最適的主發酵時間定為45 d。

2.1.4 黑曲霉曲種添加量對余甘子酵素游離氨基酸和總酚含量的影響

黑曲霉可產生蛋白酶、果膠酶和纖維素酶等，這些酶具有水解蛋白質、果膠質和纖維素等作用[39]。在固定發酵曲種為米根霉+黑曲霉、前發酵36 h，主發酵45 d、米根霉曲種添加量為質量分數0.75%的條件下，改變黑曲霉曲種添加量，測定主發酵45 d后的余甘子酵素的游離氨基酸和總酚含量，結果見圖4。

圖4 黑曲霉曲種添加量對余甘子酵素游離氨基酸和總酚含量的影響Fig.4 Effect of the addition amount of Aspergillus niger on free amino acid content and total phenol content ofPhyllanthus emblica jiaosu

由圖4可知，當黑曲霉曲種添加量由質量分數0.25%增加至0.75%時，余甘子酵素的游離氨基酸含量由2.05 mg/mL上升至4.16 mg/mL(P<0.05)，總酚含量由8.96 mg/mL上升至9.27 mg/mL(P<0.05)。當繼續添加黑曲霉曲種時，可能是因為發酵體系內存活的微生物數量有所上升，其維持生長需要消耗的營養物質也隨之增加，從而導致游離氨基酸和總酚含量的總體趨勢下降。所以，最佳的黑曲霉曲種添加量為質量分數0.75%。

2.1.5 米根霉曲種添加量對余甘子酵素游離氨基酸和總酚含量的影響

米根霉可產生糖化酶、蔗糖酶和蛋白酶等，能夠將淀粉、蔗糖、蛋白質等大分子有機物酶解為葡萄糖、氨基酸等小分子物質[39]。在固定發酵曲種為米根霉+黑曲霉、前發酵36 h，主發酵45 d、黑曲霉曲種添加量為質量分數0.75%的條件下，改變米根霉曲種添加量，測定主發酵45 d后的余甘子酵素的游離氨基酸和總酚含量，結果見圖5。

如圖5所示，隨著米根霉曲種添加量增加，余甘子酵素的游離氨基酸含量由3.70 mg/mL增加至4.16 mg/mL(P<0.05)，總酚含量由8.54 mg/mL增加至9.27 mg/mL(P<0.05)，此時米根霉曲種添加量為質量分數0.75%。

圖5 米根霉曲種添加量對余甘子酵素游離氨基酸和總酚含量的影響Fig.5 Effect of the addition amount of Rhizopus oryzae on free amino acid content and total phenol content ofPhyllanthus emblica jiaosu

當繼續添加米根霉曲種，游離氨基酸含量開始逐漸下降，總酚含量則顯著降低(P<0.05)后趨于平穩，推測其原因可能與繼續添加黑曲霉曲種相似。所以，確定最佳的米根霉曲種添加量為質量分數0.75%。

2.2 響應面優化試驗結果與分析

2.2.1 響應面試驗設計與結果

根據表1的Box-Behnken試驗因素水平設計，共制作了29組余甘子酵素，測定其游離氨基酸含量和總酚含量，并計算綜合評分。相關結果如表3所示。

利用Design-Expert軟件對表3的數據進行分析，以綜合評分為響應值進行二次多項回歸擬合，得到綜合評分(S)對前發酵時間(A)、主發酵時間(B)、黑曲霉曲種添加量(C)、米根霉曲種添加量(D)的回歸模型方程：

S=0.93-0.007 5A+0.083B+0.15C+0.14D-0.021AB-0.11AC-0.18AD+0.042BC-0.062BD-0.034CD-0.35A2-0.17B2-0.19C2-0.25D2

表3 Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Box-Behnken design and results

2.2.2 方差分析

對得到的回歸模型進行方差分析，結果如表4所示。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。

2.2.3 最優發酵工藝條件確定及驗證

通過Design-Expert軟件的進一步分析，得到了最優的發酵工藝條件為：黑曲霉曲種添加量0.86%，米根霉曲種添加量0.82%，前發酵34.12 h，主發酵48.71 d，此時余甘子酵素的綜合評分為0.99。為了驗證最優工藝的準確性，考慮實際情況，將發酵條件修正為：前發酵時間34 h，主發酵時間49 d，黑曲霉曲種添加量0.85%，米根霉曲種添加量0.80%。以修正后的工藝條件進行3次平行驗證試驗，結果取平均值，得到余甘子酵素的游離氨基酸含量為4.36 mg/mL，總酚含量為9.52 mg/mL，綜合評分為0.97，接近模型預測值。

2.3 余甘子酵素的理化特性及感官評價結果

根據2.2.3修正后的最佳工藝條件，測定對照組(無曲種)和最佳發酵工藝各自主發酵前后所得的余甘子酵素的理化特性和感官評分，進一步驗證最佳發酵工藝的優劣。結果見表5。

表5 對照組與最佳發酵工藝各自主發酵前后所得余甘子酵素的理化特性和感官評分Table 5 Physicochemical properties and sensory scores of Phyllanthus emblica jiaosu obtained before and after the mainfermentation in the control group and the optimal fermentation process

注：在同一指標中，字母相同表示無顯著性差異(P>0.05)，字母不同表示存在顯著性差異(P<0.05)。

表5中的數據顯示，與對照組相比，最佳發酵工藝主發酵后得到的余甘子酵素的游離氨基酸含量、總酚含量、還原糖含量、蛋白質含量、DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力和感官得分都顯著高于對照組主發酵前、后得到的余甘子酵素(P<0.05)，而最佳發酵工藝主發酵前得到的余甘子酵素的還原糖含量和蛋白質含量也顯著高于對照組主發酵前得到的(P<0.05)，這說明曲種的添加和前發酵對提高余甘子酵素中多種成分的含量和抗氧化性具有促進作用，這可能是因為米根霉和黑曲霉在前發酵期間產生了足夠的果膠酶、纖維素酶、蛋白酶、蔗糖酶等，這些酶本身既是蛋白質，又能作用于相應的底物，破壞余甘子果實細胞結構和水解大分子物質，使蛋白質和總酚等物質的含量升高。在最佳發酵工藝中，除pH和可溶性固形物含量之外，余甘子酵素的其他指標在經過主發酵后對比未經主發酵的均得到了明顯改善(P<0.05)，說明主發酵階段對獲得品質良好的余甘子酵素是必要的。無論是對照組還是最佳發酵工藝，主發酵后的余甘子酵素的pH值均降低，這可能是發酵過程中微生物產酸導致的。

氨基酸具有良好的營養價值和生理功能，可參與物質的合成、轉化、提供能量等，對機體代謝具有重要作用，同時也是影響食品風味和感官的重要成分[40-41]。酚類物質是重要的生物活性物質之一，有較強的抗氧化活性，因其很容易給出1個氫離子并通過共振雜化而穩定，所以自由基清除能力很高[14]，此外，酚類物質也是揮發性風味物質中的一類。本實驗最優發酵工藝條件制得的余甘子酵素含游離氨基酸4.36 mg/mL、總酚9.52 mg/mL，遠高于其他研究者開發的同類發酵食品，如楊志鵬等[42]的海棠果酵素含氨基酸1.83 mg/mL和多酚0.573 mg/mL；蔣增良[14]的樹莓、藍莓和葡萄酵素的總酚含量最大值依次為2.813、2.308和1.739 mg/mL，陳犇等[43]的梔子花酵素營養液含游離氨基酸0.42 mg/mL和總酚1.83 mg/mL，玉蘭花酵素營養液含游離氨基酸0.44 mg/mL和總酚2.68 mg/mL；李杰等[44]的核桃青皮果蔬酵素含多酚0.188 mg/mL。所以本實驗最優發酵工藝條件制得的余甘子酵素含有豐富的游離氨基酸和酚類物質，營養價值高。

3 結論

本研究先通過單因素和響應面優化試驗及修正，確定了新型余甘子酵素的最佳發酵工藝條件：原料∶糖水(ω=40%)=1∶1，米根霉曲種添加量0.80%，黑曲霉曲種添加量0.85%，前發酵34 h，主發酵49 d。其中在響應面設計及分析中，得到主發酵時間、黑曲霉曲種添加量和米根霉曲種添加量對產品的綜合評分均影響極顯著(P<0.01)，影響程度由高到低依次為黑曲霉曲種添加量>米根霉曲種添加量>主發酵時間>前發酵時間；修正條件后的余甘子酵素的綜合評分為0.97(滿分為1)。然后進一步通過分別比較對照組與最佳發酵工藝制得的新型余甘子酵素、最佳發酵工藝制得的新型余甘子酵素與其他植物類發酵食品，驗證了此最佳發酵工藝是比較好的工藝，可制作出品質良好的新型余甘子酵素飲品，其含有游離氨基酸4.36 mg/mL，總酚9.52 mg/mL，還原糖422.79 mg/mL，蛋白質26.50 mg/mL，可溶性固形物18.55%，pH為2.86，DPPH自由基清除能力和羥自由基清除能力分別為99.23%和66.91%，感官得分為82.28分，產品澄清透明呈亮黃色，氣味清香，口感柔順、酸甜可口，符合市場需求，發展前景良好。此外，本研究結果顯示了新型余甘子酵素的游離氨基酸和總酚含量發生了較明顯的改變，這2類物質與食品的風味密切相關，因此對本產品在發酵過程中其游離氨基酸和酚類物質的種類和含量的詳細變化還有待更進一步的研究。