以小米為基質牛樟芝固態發酵高產antroquinonol的條件優化

胡鵬飛，陳磊，許贛榮，張薄博

(江南大學 生物工程學院，糖化學與生物技術重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

牛樟芝(Antrodiacinnamomea，Antrodiacamphorata，Taiwanofunguscamphoratus)是我國臺灣特有的珍稀食用與藥用真菌。牛樟芝素有“神芝”、“森林中的紅寶石”之稱[1-2]?，F代研究發現，牛樟芝具有抗癌、保肝、抗炎、抗病毒、抗氧化、調節免疫以及降血脂等多種生物活性。目前，從牛樟芝子實體及菌絲體中分離得到100多種化合物，主要包括三萜、多糖、泛醌類衍生物以及馬來酸和琥珀酸衍生物等[3-7]。其中，泛醌衍生物是牛樟芝中特有的生物活性物質，具有顯著的抗癌活性和較強的抗炎活性。迄今為止，在牛樟芝分離鑒定了12種新的泛醌衍生物，其中包括antroquinonol, antroquinonol B, antroquinonol C, antroquinonol D, antroquinonol L, antroquinonol M, antrocamol LT1, antrocamol LT2, antrocamol LT3, 4-acetyantroquinonol B, 4-acetylantrocamol LT3以及antrocinnamone[8-12]。其中，antroquinonol因其具有極佳的生物活性被國內外學者廣泛關注。LEE等[8]研究發現，antroquinonol對胰腺癌、肝癌、非小細胞型肺癌以及阿爾茨海默病等具有顯著的抑制作用[13-20]，目前，antroquinonol已完成了美國FDA二期臨床實驗[21]，是具有優良前景的抗癌化合物。

牛樟芝野生子實體生長極其緩慢，且價格昂貴，無法滿足社會需求。為了改善野生牛樟芝子實體供不應求的現狀，人們對牛樟芝的人工培養進行了大量研究。目前主要有3種人工培養方式：段木栽培法、固態發酵法(包括皿培法)和液態發酵法[5, 22]。相對于液態發酵法，固態發酵牛樟芝菌絲體中活性成分含量較高、種類較多[23]。相較于段木栽培法，固態發酵周期具有時間更短，生產原料不受限制等優點。目前，國內外學者對antroquinonol的研究多集中在藥理活性研究，而對于通過發酵條件的優化和代謝調控等方式來提高樟芝菌發酵中antroquinonol產量的研究卻鮮有報道。目前，僅有以大米為基質進行牛樟芝固態發酵條件研究的報道[24-26]，其中路瑞秋等[25]通過對樟芝菌體的細胞通透性和代謝進行調控，最終antroquinonol的產量相對于對照組提升了232.1%，達865.3 mg/kg，為目前已有報道的較高水平。

然而在絲狀真菌的固態發酵過程中，有很多因素會對菌絲的生長以及次級代謝產生較為顯著的影響[27]。其中，固態發酵基質作為菌絲生長的支撐物以及營養供應具有很重要的作用[28]。有研究報道發現，不同的谷物基質對固態發酵的次級代謝產物的類型以及產量均有影響，其中SRIANTA等[29]研究發現，不同基質上的菌絲生長以及紅曲色素產量具有很大的差異，其中大米為最適的紅曲色素生產基質。TAKESHITA等[30]研究發現用黑米和貝尼曲所釀造的酒精飲料對DPPH自由基的清除活性較好。YANG等[31]研究發現，生長在燕麥上的牛樟芝菌絲體的甲醇提取物具有更強的抗氧化性。

由此可見，固態發酵基質的類型和發酵條件的篩選能顯著影響絲狀真菌固態發酵過程中活性物質的合成水平。本研究對牛樟芝固態發酵產antroquinonol的基質進行篩選，并對固態培養時間、初始含水量，接種量以及外加氮源等因素進行優化，在此基礎上結合響應面法對發酵條件進行優化篩選。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛樟芝菌，本研究室保藏菌種。

葡萄糖(純度≥99%)，上海生工。蛋白胨、酵母浸粉、酵母提取物、玉米漿粉、(NH4)2SO4、NaNO3為生化試劑，其他均為分析純。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫水浴鍋(C-86)，廣州越秀醫療器械廠；電熱恒溫培養箱(HH·B11·360)，連云港醫療器械設備廠；全溫搖床柜(HYG-A)，太倉市實驗設備廠；高壓蒸汽滅菌鍋(LDZX-40BI)，上海申安醫療器械廠；電熱鼓風干燥箱(101-1型)，上海博訊醫療設備廠；高效液相色譜(1525)，美國waters公司。

1.3 方法

1.3.1 培養基條件

牛樟芝菌接種于加富PDA斜面，28 ℃避光培養7 d，4 ℃保藏。

孢子懸浮液制備：利用無菌水將加富PDA斜面表層的孢子洗下，玻璃珠打散后鏡檢，使孢子數達到1×106個/mL。

固態種子培養：葡萄糖20 g/L，玉米漿粉12 g/L，大豆水解液35 mL/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO40.5 g/L，檸檬酸0.5 g/L，pH自然，500 mL三角瓶中裝120 mL培養基，121 ℃滅菌20 min，接種量為10 mL，28 ℃，130 r/min下培養3 d。

固態發酵培養：谷物類物質100 g，大豆水解液60 mL/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，初始pH自然，121 ℃滅菌30 min，培養基初始含水量50%，按照體積分數15%進行接種，28 ℃下培養30 d。

大豆水解液制備：稱取大豆100 g，清水浸泡24 h，用豆漿機將浸泡后的大豆打磨粉碎后加水定容至1 L，再加入質量分數為0.1%的酶活力為2～3萬的中性蛋白酶，50 ℃水浴4 h充分水解后制成質量濃度為100 g/L的大豆水解液(含氮量為6.97%)。

1.3.2 培養條件的優化

在初始固態發酵培養基的基礎上，探討了谷物類型、發酵時間、初始含水量、接種量和外加氮源種類及其添加量等發酵條件對牛樟芝固態發酵antroquinonol產量的影響，為進一步的響應面實驗確定最佳的取值。

初始含水量/%=

(1)

1.3.3 Box-Behnken試驗設計

在單因素確定的最優的谷物類物質基礎上，選取氮源添加量X1、初始含水量X2、接種量X3為自變量，antroquinonol產量Y為響應值，對牛樟芝固態發酵antroquinonol條件進行Box-Behnken試驗，設計因素如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗因素設計Table 1 Facters in Box-Behnken experiment

1.3.4 檢測與分析

1.3.4.1 牛樟芝固態發酵干物質損失的測定

研究發現，在固態發酵中干物質的損失與單位面積內生物量具有高度的相關性，因此可用干物質的損失代替生物量的變化[32-33]。將發酵所得牛樟芝固態谷物類物質在45 ℃烘箱中烘干至恒重并稱重，測定最終含水量并計算干物質損失量[34]。

(2)

1.3.4.2 牛樟芝固態發酵antroquinonol的測定

用粉碎機將烘干的谷物類物質打磨成粉末狀，在50 mL比色管中按照料液比1∶20(g∶mL)添加95%乙醇并于50 ℃水浴鍋中振蕩萃取90 min后取出，上下振蕩2～3次，冷卻至室溫后取5 mL用0.22 μm有機微孔濾膜過濾，進行HPLC分析[35]。

1.3.4.3 antroquinonol標準曲線測定

準確稱取1mg antroquinonol標準品(由本實驗室自制，純度≥95%)用乙腈溶解配制為質量濃度1 g/L的標準溶液，將其稀釋為質量濃度20、40、60、800、100 mg/L的溶液進行HPLC檢測，以antroquinonol濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.4.4 不同基質顆粒度測定

隨機選取至少25顆基質排列成一排，用游標卡尺測定，重復3次，算出不同基質的顆粒度。

1.3.4.5 大米直鏈淀粉含量測定

參照段傳玲等[36]的方法利用紫外分光光度計進行直鏈淀粉含量測定。

1.3.4.6 數據分析

Box-Behnken設計響應值按照二次多項式回歸方程模型進行回歸分析[37]

(3)

式中:Y為響應預測值；xi為自變量；β0為截距；βi為線性系數；βii為平方系數；βij為交互作用系數[38]。所有數據均使用Design-expert 8.06統計分析軟件進行回歸方差分析。

2 結果與討論

2.1 牛樟芝固態發酵產antroquinonol基質篩選

如圖1所示，在不同的谷物類物質上，牛樟芝產antroquinonol的能力有明顯差異，相比于其他的谷物類物質，最適的谷物類基質為小米，antroquinonol的產量達325.0 mg/kg，而以金龍魚粳米作為固態基質時antroquinonol產量最低，僅有29.6 mg/kg。有文獻報道，除了谷物類基質的營養成分不同之外，在固態發酵過程中基質的顆粒度對實驗結果也會有顯著的影響，顆粒較小導致培養基在培養過程中容易結團，顆粒較大會影響菌體對內部營養物質的利用[39]。如圖1所示，在不同米的類型中，小米的顆粒度最小，其次為泰國香米，其余的4種稻米顆粒度相對于這2種都較大，而antroquinonol產量也較低。同種類型的基質中，去皮小麥的顆粒度大于未去皮小麥顆粒度，因此，未去皮小麥中antroquinonol產量高于去皮小麥。但顆粒度與antroquinonol產量關系也存在特殊情況，如圖1所示，玉米粒是顆粒度最小的一種谷物類物質，但其antroquinonol產量不是最高的，觀察其發酵過程可知，由于其顆粒度過小因而發酵過程中結團較為嚴重，因此不適合牛樟芝高產antroquinonol。當用黃豆渣作為固態基質的發酵過程中發現，因其吸水性極強，基質結團十分嚴重，導致牛樟芝菌絲幾乎無法生長，因此也幾乎無法檢測到antroquinonol。另有研究表明，除了顆粒度因素之外，稻米中直鏈淀粉的含量與米的硬度、黏度以及彈性等均具有密切的關系，直鏈淀粉含量越高，米粒越硬，黏性越小，米粒干燥而蓬松，色澤灰暗，相反，直鏈淀粉含量越低，米粒軟糯，黏度較大,容易結團[40]。結合圖1的實驗數據選取幾種秈米，粳米和小米進行淀粉含量測定。

圖1 不同固態基質對牛樟芝固態發酵產antroquinonol的影響Fig.1 Effect of different substrates on the production of antroquinonol in solid-state fermentation of Antrodiacinnamomea

由表2可知，江蘇粳米和金龍魚粳米的直鏈淀粉含量較低，黏度較大，因此antroquinonol產量也相對較低。而泰國香米和廣西早稻米的直鏈淀粉含量都相對較高，這就導致在固態發酵過程中米粒硬度較大，營養利用不充分，antroiquinonol產量也不高。而小米中直鏈淀粉的含量處于較為適中的水平，antroquinonol的產量相對較高。除了直鏈淀粉外，也有研究報道基質中的蛋白含量，C/N比以及維生素含量也會影響絲狀真菌的生長以及代謝，其中劉愛英等[41]研究發現，蛋白含量高，C/N比小以及堊白度適中的稻米較適合紅曲菌固態發酵產莫納可林K。

表2 不同米中直鏈淀粉含量對牛樟芝固態發酵的影響Table 2 Effect of amylose content in different kinds of rice in solid-state fermentation of Antrodia cinnamomea

馮衫等[42]研究表明，在固態基質中添加的維生素對槐耳菌絲生長具有明顯促進作用，但結合本實驗基質篩選發現，稻米中只有小米和泰國香米對antrqouinonol的產生有明顯促進作用，而廣西早稻米、江蘇粳米、南方粳米、金龍魚粳米中antroquinonol的產量要少于玉米渣以及2種小麥，這表明不同蛋白以及維生素含量可能也是影響菌體生長和antroquinonol產生的重要因素。因此，選用小米作為最佳的固態發酵基質進行后續實驗。

2.2 牛樟芝固態發酵時間對antroquinonol產量的影響

本文在以小米為固態發酵基質的基礎上對牛樟芝發酵的周期進行確定。由圖2所示，隨著發酵時間的增加，基質干物質的損失在不斷增加，而在第17天時，固態基質的消耗速率變慢，說明菌絲生長進入了穩定期。相比于干物質消耗，antroquinonol在第12天開始合成，到第25天時產量達到最大，隨后隨著發酵時間的增加，antroquinonol的產量有所下降。因此，選取最佳發酵時間為25 d，antroquinonol產量為372.6 mg/kg。

圖2 發酵時間對牛樟芝固態發酵產antroquinonol的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the production of antroquinonol in solid-state fermentation of Antrodiacinnamomea

2.3 接種量對牛樟芝固態發酵antroquinonol產量的影響

在固態發酵過程中，接種量會對菌絲的生長和代謝產物的合成有著顯著的影響[43]。因此后續選取不同的接種量進行優化實驗。由圖3所示，隨著接種量的增大，基質干物質的損失在逐漸增大，而antroquinonol的產量呈先增大后減少趨勢，這說明當接種量超過一定的程度后，大部分的基質會過多地用于牛樟芝菌絲體的生長而不利于antroquinonol的合成。當接種量為20 mL/100g基質，antroquinonol的產量最高，可達952.6 mg/kg。因此，在后續實驗中以接種量為20 mL/100g基質進行實驗。

圖3 接種量對牛樟芝固態發酵產antroquinonol的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on production on antroquinonol in solid-state fermentation ofAntrodia cinnamomea

2.4 固態發酵初始含水量對牛樟芝固態發酵antroquinonol產量的影響

初始含水量過高或者過低均不利于菌絲生長以及次級代謝的正常進行[44-45]。如圖4所示，當初始含水量在40%時，antroquinonol的產量最高，可達1 318.1 mg/kg，而當初始含水量進一步增加或者減少時均不利于antroquinonol的生產。結合干物質損失分析發現，當含水量過高時，小米結團嚴重，導致基質間的氧傳遞不足，菌絲無法深入基質內部生長，因此，小米的消耗降低，營養利用不充分，而當含水量過低時，雖基質松散，但因小米本身比較硬，也不利于牛樟芝菌絲的生長。因此后續實驗選擇40%作為最佳的初始含水量。

圖4 初始含水量對牛樟芝固態發酵產antroquinonol的影響Fig.4 Effect of initial moisture content on production on Antroquinonol in solid-state fermentation ofAntrodia cinnamomea

2.5 外加氮源對牛樟芝固態發酵antroquinonol產量的影響

在微生物生長過程中，合適的碳氮源是必不可少的，在固態發酵過程中，固態基質可為其提供充足的碳源，而多數情形下，外加氮源可有效地促進菌體的生長和代謝產物的合成[46]。因此，在上述實驗結果的基礎上，對外加氮源進行篩選和優化。實驗過程中選取了6種氮源，其中有機氮源4種：酵母蛋白胨，酵母粉浸膏，大豆水解液,安琪酵母粉;無機氮源2種：硫酸銨，硝酸鈉。如圖5所示，在不同氮源的條件下，牛樟芝固態發酵產antroquinonol的能力有著顯著的差異。

A-F分別為：酵母蛋白胨、酵母粉浸膏、大豆水解液、硫酸銨、安琪酵母粉、硝酸鈉圖5 不同氮源對牛樟芝固態發酵產antroquinonol的影響Fig.5 Effect of different nitrogen sources on production on antroquinonol in solid-state fermentation ofAntrodia cinnamomea

相比于其他幾種氮源，大豆水解液中含有大量的水解大豆肽以及氨基酸等，更容易被吸收利用[47-48]，因此以大豆水解液為氮源的固態發酵過程中，干物質的損失以及antroquinonol的產量相比于其他幾種氮源要高，說明大豆水解液不僅僅能夠很好的促進牛樟芝固態基質上菌絲的生長而且可以促進antroquinonol的合成，在此條件下，固態發酵結束后antroquinonol產量約為1194.9 mg/kg。因此后續實驗以大豆水解液為最佳氮源。

2.6 外加氮源含量對牛樟芝固態發酵antroquinonol產量的影響

在上述實驗基礎上，對大豆水解液的添加量進行優化，結果如圖6所示。

圖6 氮源含量對牛樟芝固態發酵產antroquinonol的影響Fig.6 Effect of nitrogen source on production on antroquinonol in solid-state fermentation ofAntrodia cinnamomea

發現當大豆水解液含量為80 mL/L時，固態發酵牛樟芝菌絲體產antroquinonol的能力最好，最終產量為1 395.8 mg/kg，是未優化的小米固態發酵對照組的4.3倍。

2.7 響應面實驗設計結果及分析

根據單因素優化結果，選取外加氮源量(X1),基質初始含水量(X2)以及接種量(X3)為主要影響因素，根據3因素3水平設計17個實驗水平，具體如表3所示。

表3 Box-Behnken試驗設計和實驗結果表3 Box-Behnken design matrix along with theexperimental values of antroquinonol

注：a:3次實驗平均值；b:偏差(%)=(預測值-實驗值)×100/實驗值

運用Design-expert 8.0對表3的數據進行二次回歸擬合，Box-Behnken試驗設計數據回歸分析結果見表4。軟件擬合牛樟芝固態發酵產antroquinonol回歸方程如下:

表4 Antroquinonol產量回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance for the antroquinonolregression model

注：***：P<0.001 差異極顯著; **：P<0.01 差異高度顯著;*：P<0.05 差異顯著

通過軟件Design Expert 8.06軟件求解方程得出，預測的最優條件為X1=0.12，X2=0.2，X3=0.18，即當氮源添加量為82.4 mL/L，初始含水量為41%，接種量20.9%時，antroquinonol產量最大，預測產量為1 336.0 mg/kg。考慮實際實驗操作，修正最優條件為氮源添加量為82.4 mL/L，初始含水量為41%，接種量21%。為進一步驗證模型可靠性，采用修正后的條件進行驗證實驗，測得antroquinonol的產量為1 340.7 mg/kg(為3組重復所得平均值)，相對于預測值而言，實際值偏差-0.4%，二者基本吻合，因此該優化模型可靠。實驗結果是未優化前(325.0 mg/kg)的4.1倍。

3 結論

本實驗以牛樟芝中具有顯著生理活性的antroquinonol為目標產物，應用響應面分析法探究了在以小米為基質的牛樟芝固態發酵過程中不同因素對antroquinonol產量的影響。首先，通過單因素實驗，確定了發酵周期、初始含水量、接種量以及氮源類型和添加量均會對antroquinonol的產量有顯著影響。其次，在此基礎上，采用3因素3水平的Box-Benhnken中心組合實驗原理設計響應面分析實驗，得到最佳的發酵條件為：小米100 g，大豆水解液82.4 mL/L，初始含水量41%，接種量21 mL/100 g基質，發酵25 d。在此條件下，牛樟芝固態發酵產antroquinonol為1 340.7 mg/kg，是未優化前(325.0 mg/kg)的4.1倍，為目前已有文獻報道中的最高水平。