真空低溫烹飪對牛肉微觀結構與理化性質的影響

孟祥忍，王恒鵬，謝靜，屠明亮，吳鵬，陳勝姝，高子武，李武，時浩然

1(揚州大學，江蘇 揚州,225127) 2(江蘇省淮揚菜產業化工程中心，江蘇 揚州，225127)

真空低溫烹飪技術(sous vide cooking, SVC)源于法國，是19世紀70年代中期Georges Pralus為Troisgros餐廳研發的一種新派烹飪方式，即將食物原料在熱穩定真空裝置中以可控溫度與時間進行蒸煮加熱[1]。低溫烹飪溫度一般控制在50～80 ℃，在低溫環境下設定較長時間去加熱食材，可消滅絕大部分有害菌。RINALDI等[2]研究表明，60～70 ℃的加熱溫度能抑制大部分細菌的生長，適用于魚肉、牛肉、羊肉的烹飪加工，71～80 ℃的加熱溫度則適用于禽類和豬肉的加工。

牛肉是世界三大肉類消耗品之一，含有豐富的蛋白質、肽類及氨基酸，相比于其他肉類更接近人體攝入營養素的需求[3]。傳統的高溫加熱不僅造成牛肉的口感下降，還易造成各類風味、營養物質的嚴重損失，而真空低溫技術在基于牛肉安全烹飪溫度的基礎上，采用真空包裝隔絕氧氣，既可有效保證食材內外溫度的均勻性，又可確保牛肉食用的安全性。同時，真空低溫烹飪能夠極大限度地減少食材的質量損失及水分流失，較好地保留住食材本身的風味與營養，使烹飪后的食物具有更好的口感，符合現代人們對膳食品質的高要求[4]。

本試驗以澳洲西冷牛肉為研究對象，將其真空處理后分別在不同低溫環境下加熱，探究真空低溫烹飪對牛肉微觀結構與理化性質的影響，以期為我國傳統肉制品的加工技術提供新思路與方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

澳洲冰鮮牛西冷(婆羅門牛)，泰氏澳洲賓利市有限公司；多聚甲醛、無水乙醇、二甲苯、中性樹膠、伊紅染液、蘇木精染液均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；鹽酸、冰醋酸均為分析純，南京博爾迪生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

MK-301型熱電偶接觸式測溫儀，杭州美控自動化技術有限公司；GTR16-2型高速冷凍離心機，北京時代北利離心機有限公司；TMS-Pro物性測定儀，美國FTC公司；SC-80C型全自動色差計，北京康光光學儀器有限公司；HH-6型電熱恒溫水浴鍋，山東博科生物產業有限公司；BS210S(1/1000)型電子天平，北京賽多斯儀器系統有限公司；ZH型真空包裝機，上海鑄衡電子科技有限公司；MEV冷凍切片機，德國SLEE公司；Optika XDS-3FL4型倒置熒光顯微鏡，上海長方光學儀器有限公司；KD-BM型石蠟包埋機、KD-BL型樣品冷卻臺，浙江科迪儀器設備有限公司；KPJ-1A型展片機、ZPJ-1A型烤片機，天津天利航空機電有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

剔除西冷牛肉表面筋腱、肌膜，將其切割成規格為5 cm×5 cm×1.5 cm的整塊肉樣。將肉樣分為5組，每組6塊。先將熱電偶溫度探頭插入未經真空包裝的樣品中心位置，按組分別置于60、65、70、75和100 ℃的恒溫水浴鍋中加熱，密封袋開口朝上，開始加熱并計時，實時監控樣品的中心溫度變化，記錄樣品中心溫度分別達到對應水浴溫度時所需的加熱時間，每個條件重復3次，取平均值。后將測試肉樣真空包裝后，利用每組樣品達到對應中心溫度所需時間進行水浴加熱，當肉樣中心溫度達到60 ℃(加熱28～32 min)、65 ℃(加熱46～50 min)、70 ℃(加熱60～65min)、75 ℃(加熱82～86 min)和100 ℃(加熱165～170 min)時取出肉樣，冷卻至室溫(20±2) ℃，待測。

1.3.2 微觀結構

1.3.2.1 石蠟切片制備

取出已固定好的牛肉組織，切割成2.5 mm×2.5 mm×3 mm大小，進行組織脫水，包埋和切片。

具體步驟：70%乙醇3 h→80%乙醇45 min→95%乙醇Ⅰ 40 min→95%乙醇Ⅱ 40 min→無水乙醇Ⅰ 40 min→無水乙醇Ⅱ 30 min→二甲苯Ⅰ 30 min→二甲苯Ⅱ 40 min→石蠟Ⅰ 1 h→石蠟Ⅱ 1 h→石蠟Ⅲ 1 h。

包埋：將熔化的石蠟倒入包埋框再將組織塊放入，放入時不能有氣泡，冷卻30 min。

常規石蠟切片：厚度4 μm，連續切片。

烤片：60 ℃烤片30 min，室溫保存。

1.3.2.2 HE染色和封片

采用組織學HEMATOXYLIN & EOSIN (H.E.)[5]染色方法，具體步驟：

(1)選取待染色切片，62 ℃烤片1 h。

(2)對切片進行脫蠟，復水。

二甲苯Ⅰ 10 min→二甲苯Ⅱ 10 min→二甲苯：無水乙醇(1∶1) 10 min→無水乙醇Ⅰ 5 min→無水乙醇Ⅱ 5 min→95%乙醇Ⅰ 2 min→95%乙醇Ⅱ 2 min→80%乙醇2 min→70%乙醇2 min→雙蒸水5 min。

(3)蘇木精液染色

蘇木精液染色4 min，流水沖洗2 min，1%鹽酸酒精溶液分色1～3 s，流水沖洗至返藍，鏡檢。

(4)伊紅液染色

伊紅液染色90 s，蒸餾水稍洗，鏡檢。

(5)脫水、透明、封片

95%乙醇Ⅰ 30 s→95%乙醇Ⅱ 1 min→無水乙醇 3 min→二甲苯：無水乙醇(1∶1) 3 min→二甲苯Ⅰ 5 min→二甲苯Ⅱ 5 min→中性樹膠封片。

1.3.3 理化性質

1.3.3.1 質構特性

采用TMS-Pro物質分析儀，對牛肉樣品的硬度、彈性、咀嚼性、膠黏性、內聚性和黏附性進行測定。設置測定參數為：P/36.5柱形探頭，測前速度60 mm/min，測試速度120 mm/min，測試形變量50%，觸發力0.4 N。

1.3.3.2 嫩度

選用國產C-LM2型肌肉嫩度儀進行牛肉樣品嫩度的測定。將肉樣用直徑1.27 cm的圓形取樣器沿與肌纖維平行的方向鉆取肉樣(避開筋腱)，孔樣長度不少于2.5 cm，取樣位置距離樣品邊緣不少于5 mm，兩個取樣的邊緣間距不少于5 mm，剔除有明顯缺陷的孔樣，測定樣品數量不少于3個，取樣后立即測定。

1.3.3.3 色澤

將便攜式色差儀經白板校準后，測定牛肉樣品的L*值(亮度)、a*值(紅度)、b*值(黃度)、C值(色彩強度)。將色差儀鏡頭垂直放置于牛肉表面測量，鏡口緊貼肉面(避免漏光)，記錄顯示屏上的各個值，每個樣品選取不同的截面測定3次，測量時要有意識地將色差儀測定位置均勻，分布在牛肉肌肉表面，記錄L*、a*、b*及C值(a*2+b*2)0.5。

1.3.3.4 pH

參照GB 5009.237—2016采用pH儀測定。取10.0 g牛肉樣品剪碎，加入90 mL pH為7.0的蒸餾水浸泡30 min并不停攪拌，再用pH儀進行檢測，待數值穩定后讀數，測定樣品數量不少于3個，取平均值。

1.3.3.5 持水力(WHC)

參照ZHOU YANZI等人[6]的離心方法，略作修改。取10.0 g左右的牛肉樣品切碎放入離心管中，記為Wa，置于轉速為7 000 r/min的冷凍離心機中離心20 min，離心結束后將肉樣取出并用濾紙吸干樣品表面水分并稱重，記為Wb。按公式(1)計算牛肉的持水力：

(1)

1.3.3.6 消化特性

采用胃蛋白酶-胰蛋白酶兩步消化法模擬胃及腸部的消化過程，測定牛肉蛋白質的胃消化率和胃腸總消化率。參照楊萬君[7]、ESCUDERO等人[8]的方法，略作修改。先用蛋白質BCA試劑盒測定牛肉原始樣品中的蛋白質含量，記為P0。準確稱取5.0 g牛肉樣品置于50 mL離心管中，每個消化樣品同時準備2組，在每組樣品中各加入20 mL雙蒸水，在冰浴環境下首先于9 500 r/min條件勻漿2次，每次30 s，后于13 500 r/min條件勻漿2次，每次30 s，每次勻漿前需間隔30 s對樣品進行冷卻處理。勻漿結束后，用1 mol/L的HCl將待測樣品pH調至2.0±0.1，以肉的質量為基準，按31.25∶1的比例加入0.16 g的胃蛋白酶(酶活≥400 U/g)，將此混合樣品置于37 ℃的恒溫搖床中振搖2 h，反應結束后迅速加適量1 mol/L的NaOH溶液將酶解液pH調至7.5±0.1滅活胃蛋白酶，離心后棄上清液，用蛋白質BCA試劑盒測殘渣中的蛋白含量，記為P1，求出胃消化率。另一組從搖床中取出，加適量1 mol/L的NaOH溶液滅活后，以肉的重量為基準，按50∶1的比例加入0.1 g胰蛋白酶(酶活≥1 645 U/g)，將混合樣品置于37 ℃的恒溫搖床中繼續振搖2 h，反應結束后迅速將消化樣品置于95 ℃恒溫水浴鍋中加熱5 min終止酶解反應，完成樣品的消化。將消化好的樣品于4 ℃冷凍離心機中離心20 min，離心力10 000×g，去除上清液，用蛋白質BCA試劑盒測定殘渣的蛋白質含量，記為P2，求得胃腸總消化率。按公式(2)、(3)計算牛肉的體外消化率：

(2)

(3)

1.3.4 數據處理

所有數據用平均值±標準差表示。采用Microsoft Office Excel 2003制表和繪圖，SPSS 17.0全因子模型對測定結果進行顯著性分析和方差分析。差異顯著水平α為0.05。

2 結果與分析

2.1 真空低溫烹飪對牛肉微觀結構的影響

圖1顯示了不同真空低溫加熱條件下牛肉微觀結構的變化情況，紅色為肌纖維，白色為肌內膜，呈網狀結構[9]。肌肉組織結構是影響肉品質的重要內在因素，結締組織、肌纖維直徑、密度、面積比例、肌節長度等都會影響肌肉品質[10]，通常肌纖維越細、密度越大，肉質越嫩。由圖1可知，在60～65 ℃低溫加熱條件下，牛肉組織結構較為松散，肌束膜與肌纖維分離度較小，肌肉細胞分布緊密，肉質較為細嫩。隨著加熱溫度的升高，牛肉中由膠原纖維組成的肌膜與結締組織進一步發生熱收縮，原來卷曲包繞在肌纖維四周的肌內膜和肌束膜與肌纖維發生分離，肌纖維逐漸沿橫、縱向伸長膨脹，肌纖維直徑顯著增大，肌束膜緊密包裹肌纖維，肌肉組織變得更加緊致，宏觀上表現為肌肉嫩度的降低，在60～70 ℃低溫加熱的牛肉中尤為明顯。由于加熱溫度的進一步升高，在75、100 ℃加熱條件下，牛肉肌纖維繼續拉伸膨脹，熱溶性膠原纖維生成的膜結構內收縮張力逐漸消失[11]，肌纖維之間產生孔洞，肌內膜發生斷裂，肌纖維間隙不斷增加，可溶性膠原蛋白和結締組織發生液體化，隨水分一起流出[12]，肌纖維也因此變得松散與不規則。

a-60 ℃加熱；b-65 ℃加熱；c-70 ℃加熱；d-75 ℃加熱；e-100 ℃加熱圖1 真空低溫烹飪過程中牛肉微觀結構的變化(× 400) Fig.1 The changes in microstructure of beef duringsous vide cooking (× 400)

2.2 真空低溫烹飪對牛肉理化性質的影響

2.2.1 質構特性

由表1可知，牛肉的質構特性在不同真空低溫加熱條件下變化顯著(P<0.05)。內聚性主要反映對食物咀嚼時的抵抗性指標[13]，牛肉的內聚性在75 ℃加熱條件下達到最高值，在60 ℃加熱條件下最低。彈性主要反映食物在撤去外力后的恢復程度[14]，60 ℃加熱條件下牛肉的彈性最小，與其他溫度組差異顯著(P<0.05)。膠黏性是指將半固體食品咀嚼至可吞咽時需做的功[13]，牛肉在65、70、100 ℃加熱條件下的膠黏性無顯著差異(P<0.05)，與60、75 ℃差異顯著(P<0.05)。咀嚼性是指將固體食品咀嚼至可吞咽時需做的功[15]，牛肉在70與100 ℃加熱條件下表現出較高的咀嚼性，在60 ℃加熱條件下咀嚼性最低，比70 ℃時減少22.78 mJ。硬度主要表示牙齒間壓迫樣品所需的最大力，能較好反映出牛肉的嫩度[15]。60 ℃加熱條件下牛肉的硬度最小，僅為46.00 N，到70 ℃升至71.63 N，隨后又有明顯減小(P<0.05)。綜合看來，以常溫100 ℃為對照，在真空低溫加熱過程中，牛肉的彈性、膠黏性、咀嚼性、硬度隨溫度的升高呈先增大后減小趨勢，分別在60、70 ℃加熱條件下有極小值和極大值，主要與肌原蛋白在60～70 ℃加熱過程中逐漸變性并收縮有關。已知彈性、硬度和咀嚼性對產品的綜合評價影響最大[16]，結果顯示60、65 ℃加熱條件下的牛肉具有較好的質構特性。

表1 真空低溫烹飪過程中牛肉質構特性的變化Table 1 The changes in texture properties of beef during sous vide cooking

注：同列肩標字母不同表示差異顯著(P<0.05)，相同表示差異不顯著(P>0.05)。

2.2.2 嫩度

剪切力大小可直觀反映肉品的嫩度好壞，是評價牛肉嫩度的首要指標[17]。肉品剪切力參數大小主要與其蛋白結構在加熱過程中的變化有關[18]。由圖2可知，以常溫100 ℃為對照，在不同真空低溫加熱條件下，牛肉的剪切力值隨溫度的升高呈先增大后減小趨勢，于70 ℃產生峰值，75 ℃又有明顯減小(P<0.05)。前人研究表明，在60～70 ℃加熱條件下牛肉剪切力逐漸增大主要與其肌原纖維蛋白的熱變性和肌肉結締組織發生熱收縮有關[19]。在75 ℃、100 ℃牛肉剪切力的減小主要由于加熱溫度的升高使得肌間膠原蛋白發生熱變性而使肌束膜和肌內膜的完整性遭到破壞，肌肉纖維變得更加松散和不規則，同時肌肉可溶性膠原蛋白的溶解度增加，這與PALKA[20]、孫紅霞等人[21]的研究結果一致。

圖2 真空低溫烹飪過程中牛肉嫩度的變化Fig.2 The changes in tendernes of beef during sous videcooking

2.2.3 色澤

色澤是消費者在決定購買牛肉產品前首先考慮的重要屬性[22]。由表2可得，隨著加熱溫度的升高，亮度L*值總體呈先增大后減小再增大趨勢，在65 ℃加熱條件下牛肉的L*值顯著高于其他樣品組(P<0.05)，70 ℃加熱條件下的牛肉L*值最小，僅為22.83，隨后有緩慢增大，主要由加熱過程中牛肉內部水分流失至表面的程度有關。牛肉的紅度a*值隨加熱溫度的升高逐漸減小(P<0.05)，75 ℃與100 ℃加熱條件下的牛肉a*值顯著小于其他樣品組，而60與65 ℃加熱條件下的牛肉樣品具有較高的a*值，主要由于低溫加熱極大減少了對肌紅蛋白的破壞，而高溫加熱導致肌紅蛋白周圍失水后生成高鐵肌紅蛋白[23]，肌肉也由鮮紅色變為棕褐色。低溫烹飪過程中牛肉黃度b*值的變化趨勢與L*值基本保持一致，牛肉的b*值在65 ℃加熱條件下達到最大，為4.15，而在70 ℃加熱條件下減小至2.02。C值主要表示肌肉的色彩強度，牛肉的C值隨加熱溫度的升高呈先增大后減小趨勢，在60～65、70～75及100 ℃加熱條件下具有顯著差異(P<0.05)，65 ℃加熱條件下的牛肉具有最好的色彩強度，常溫100 ℃對照組的牛肉色彩強度最差，顯示隨著加熱溫度的升高，牛肉會逐漸變得黯淡、無光澤。

表2 真空低溫烹飪過程中牛肉色澤的變化Table 2 The changes in colour of beef during sousvide cooking

注：同列肩標字母不同表示差異顯著(P<0.05)，相同表示差異不顯著(P>0.05)。

2.2.4 pH與持水力(WHC)

pH值是衡量牛肉品質的關鍵參數[24]。由表3可知，真空低溫烹飪對牛肉的pH有顯著影響(P<0.05)，在65 ℃加熱條件下牛肉的pH明顯降低，到70 ℃又有明顯升高，這可能與溫度破壞穩定蛋白質結構的化學鍵使其在加熱后酸性基團減少有關[25]。70 ℃后牛肉的pH略有降低并趨于穩定，可能因肌肉中的脂肪在加熱過程中發生部分水解生成脂肪酸而使pH降低[26]。

表3 真空低溫烹飪過程中牛肉pH和WHC的變化Table 3 The changes in pH and WHC of beef duringsous vide cooking

注：同列肩標字母不同表示差異顯著(P<0.05)，相同表示差異不顯著(P>0.05)。

持水力(water holding capacity, WHC)可以反映肉品的保水性能，除了影響肉的食用品質外，還具有重要的經濟學意義[27]。當加熱溫度在60～65 ℃之間，牛肉的WHC有顯著提高(P<0.05)。65 ℃后牛肉的WHC隨著加熱溫度的升高逐漸下降，且差異明顯(P<0.05)。牛肉的WHC在65 ℃低溫加熱條件下高達86.71%，而在100 ℃常溫加熱條件下降低至76.32%，主要與加熱過程中牛肉的肌纖維結構逐漸變得松散與不規則，使得肌肉內部水分在外力作用下易流失所致。

2.2.5 消化特性

為模擬人體胃腸消化環境，采用兩步消化法構建牛肉的體外消化模型。由圖3可知，真空低溫烹飪對牛肉的體外消化率具有顯著影響(P<0.05)。當加熱溫度在60～70 ℃之間，牛肉蛋白質的胃消化率無顯著差異(P<0.05)。隨著加熱溫度的繼續升高，牛肉蛋白質的胃消化率開始有了明顯下降(P<0.05)，而75與100 ℃加熱條件下的胃消化率并無顯著差異(P>0.05)，可能因為熱誘導氧化和肌原纖維蛋白表面疏水性的增加引起蛋白質聚集，進一步降低胃蛋白酶消化率[28]。與胃消化率相比，牛肉蛋白質的總體消化率均有明顯增大，主要因為食物從胃進入小腸后，蛋白質不完全水解產物會在腸液中進一步被分解，且胰蛋白酶酶解作用更強，可將蛋白質、肽徹底分解為氨基酸[29]。常溫100 ℃對照組除外，經胃蛋白酶-胰蛋白酶聯合處理的牛肉蛋白質總消化率均在90%以上，且隨加熱溫度的升高呈先增大后下降趨勢，差異顯著(P<0.05)。低溫65 ℃牛肉蛋白質的總消化率高達96.27%，而在75、100 ℃加熱條件下，牛肉蛋白質的總消化率下降明顯(P<0.05)，與PROMEYRAT[30]、WEN等[31]的研究結果一致。

圖3 真空低溫烹飪過程中牛肉消化特性的變化Fig.3 The changes in digestion characteristics of beef during sous vide cooking

3 結論

真空低溫烹飪對與牛肉微觀結構和理化性質相關的各項指標均有顯著影響。以常溫100 ℃為對照，在不同真空低溫烹飪條件下，對產品綜合評價影響最大的彈性、硬度和咀嚼性隨著溫度的升高呈先增大后減小趨勢，結果顯示低溫60、65 ℃加熱條件下的牛肉具有較好的質構特性。低溫70 ℃加熱條件下牛肉的嫩度較差，主要與其肌原纖維蛋白的熱變性和肌肉結締組織發生熱收縮有關，而繼續升高溫度會引起肌束膜和肌內膜的完整性遭到破壞，肌肉纖維變得松散和不規則，使得牛肉的嫩度得到改善，與微觀結構的結果一致。色澤受加熱溫度的影響較大，低溫60、65 ℃加熱條件下的牛肉具有較好的色澤，隨著加熱溫度的升高，牛肉逐漸變得黯淡、無光澤。真空低溫烹飪對牛肉的pH與WHC均有顯著影響，低溫65 ℃加熱條件下的牛肉保水性最好，且此時牛肉蛋白質的體外消化率遠高于常溫100 ℃加熱的，顯示經低溫烹飪后的牛肉產品更利于機體的消化吸收。