藍色和紫色小麥多酚提取物的體外抗氧化活性評價

劉富明，母婷婷，王彩霞*，李誠，蒲至恩

1(四川農業大學 食品學院，四川 雅安，625014) 2(四川農業大學 農學院，四川 成都，611130)

彩色小麥是我國雜交培育的特色小麥，因其較高的營養價值和保健功能[1-2]，深受消費者的關注。部分研究證實有色谷物的抗氧化活性高于普通品種，這與谷物籽粒中酚類化合物的存在密切相關[3]。

多酚是植物化學元素的統稱，因具有極強的抗氧化能力，能夠有效地保護體內生物大分子免受氧化損傷[4-5]。酚類常以不可溶性和可溶性共軛形式存在[6]，根據提取方法和結合方式的不同，主要分為游離酚和結合酚[7]。目前已有較多雜糧谷物中酚類的研究，如延莎等[8]證實了不同米色小米多酚對自由基有較好的清除效果。王鵬等[9]研究了雜糧多酚提取物的抗氧化能力，發現酚類含量及結構中酚羥基數量決定抗氧化能力。申迎賓等[10]采用不同溶劑進行青稞多酚提取及抗氧化研究，發現青稞酚含量與抗氧化效果顯著相關。當前谷物酚類的研究大多僅關注游離酚的含量及抗氧化活性，往往忽略對結合酚的研究[11-12]。本試驗選取彩色小麥中的藍色和紫色小麥作原料，分別提取游離酚和結合酚，并對其體外抗氧化活性進行研究，以期為彩色小麥資源的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍色小麥(蜀藍麥1701)、紫色小麥(蜀紫麥1701)、普通小麥(蜀麥969)，四川農業大學農學院提供，麥樣清洗除雜后置于40 ℃干燥箱中4 h烘干，粉碎過100目篩備用；無水乙醇、甲醇、丙酮、正己烷、濃H2SO4、乙酸乙酯、福林酚試劑、Na2CO3、鄰苯三酚、水楊酸等試劑均為分析純,雅安萬科化學試劑；沒食子酸,純度≥ 99%，成都科龍化工試劑；二苯基苦肼基自由基(DPPH),純度≥ 99%，美國sigma。

1.2 儀器設備

超聲波清洗器(410HT)，深圳科利爾電子科技有限公司；旋轉蒸發器(RE52CS-1)，上海亞榮生化儀器公司；冷凍離心機(ST26R)，北京聯合科力科技有限公司；酶標儀(nfinite M200)，瑞士TECAN公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 游離酚提取[13]

準確稱取1 g小麥粉，以60%乙醇、60%甲醇和60%丙酮為溶劑，在料液比1∶20(g∶mL)50 ℃下超聲(功率240 W)提取10 min，再經真空抽濾，45 ℃旋蒸后濃縮液于-20 ℃保存待測。

1.3.2 結合酚提取[14]

將已提取過游離酚后的小麥殘渣按1∶20(g∶mL)加入正己烷，振蕩后離心(4 000 r/min，5 min)，棄上清液，加入20 mL質量濃度為10%的硫酸，75 ℃水浴1 h，再分別加入20 mL乙酸乙酯萃取5次，離心(4 000 r/min，5 min)，合并萃取相后于45 ℃下旋蒸，將殘余物定容，0.45 μm濾膜過濾，得到濃縮液-20 ℃保存待測。

1.3.3 多酚含量測定

福林酚法[15-16]

1.3.4 體外抗氧化實驗

1.3.4.1 清除DPPH自由基能力測定

參考文獻[17]略修改。將DPPH配成0.2 mmol/L，避光備用。將樣品和DPPH按體積比1∶1混勻，室溫避光30 min，于517 nm處測吸光值，空白組以DPPH代替樣品，對照以無水乙醇代替DPPH，重復測定3次。按公式(1)計算DPPH清除率：

(1)

式中：I表示自由基清除率，%；A1表示樣品吸光度；A2表示對照吸光度；A3表示空白吸光度。

1.3.4.2 清除ABTS自由基能力測定

參考文獻[18]略修改。將2.6 mmol/L的過硫酸鉀與7.4 mmol/L ABTS溶液按體積比1∶1混合，置于避光室溫下16 h，在734 nm下用磷酸鹽緩沖液調吸光度為0.7±0.002。將0.1 mL樣品與5 mL ABTS混勻，室溫避光20 min后，在734 nm下測吸光度值。空白以蒸餾水代替樣品，對照以蒸餾水代替ABTS。按式(1)計算ABTS清除率。

1.3.4.3 清除超氧陰離子自由基能力測定

參考文獻[19]略修改。 取50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液和1 mmol/L的EDTA溶液各1 mL與1.5 mL樣品混合，加入1 mL 0.4 mmol/L鄰苯三酚，混勻，靜置10 min，加入100 mmol/L二硫蘇糖醇30 μL終止反應，在1 h內于325 nm下測吸光值，空白以蒸餾水代替樣品，對照以蒸餾水代替鄰苯三酚溶液。按式(1)計算超氧陰離子清除率。

1.3.4.4 清除羥自由基能力測定

參考文獻[20]。

1.3.4.5 總還原力測定

參考文獻[21]。

1.3.4.6 數據分析

實驗數據為3次重復實驗的平均值，以SPSS 19.0軟件Duncan法進行差異顯著性分析，采用Excel 2016作圖。

2 結果與分析

2.1 提取方法對小麥多酚得率的影響

游離酚和結合酚提取結果如圖1所示，幾種提取溶劑中60%的乙醇溶液對游離酚提取效率高于甲醇和丙酮(圖1-a)。根據相似相溶原理，選60%的乙醇作為游離酚提取溶劑，得到藍色小麥、紫色小麥及普通小麥游離酚含量依次為：(1 000±21)、(950±19)、(758±23) μg/g。將60%乙醇提取過游離酚后收集的麥渣經水解提取結合酚，得到結合酚含量依次為：(1 130±28)、(1 020±26)、(869±20) μg/g (圖1-b)。綜上，藍色小麥和紫色小麥的多酚含量顯著高于普通小麥，這與ARRANZ[22]和徐元元[23]等結論保持一致。

a-游離酚;b-結合酚圖1 小麥樣品中酚類含量Fig.1 Polyphenol contents in wheat注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 DPPH自由基清除能力

DPPH是性質穩定的自由基，參與生命活動，自由基過量易引起氧化應激，提高發病率。研究表明,抗氧化劑對DPPH清除依賴其供氫能力，DPPH接受抗氧化劑的氫原子使奇數電子的氮原子減少，促使體系中自由基降低[24]。由圖2可知，樣品中游離酚和結合酚對DPPH均有較好清除效果，隨質量濃度增加DPPH清除率增強，清除DPPH強弱順序為藍色小麥、紫色小麥、普通小麥。當小麥質量濃度在40 mg/mL時，藍色小麥、紫色小麥及普通小麥游離酚的DPPH清除率依次為：(77.4±2.9)%、(71.2±3.3)%、(66.1±2.7)%，其IC50值依次為：14.7、24.1、28.5 mg/mL；結合酚DPPH清除率依次為：(90.1±2.2)%、(89.2±1.9)%、(86.3±2.3)%，其IC50值依次為：7.3、8.4、10.1 mg/mL。3組樣品中結合酚的IC50值均低于游離酚，說明結合酚對DPPH清除效率更強。楊希娟等[14]通過對不同粒色青稞中游離酚和結合酚的抗氧化活性進行評價，發現酚類化合物對自由基清除具有選擇性，結合酚對DPPH可能具備更好的清除效果。

a-游離酚;b-結合酚圖2 DPPH自由基清除能力Fig.2 Scavenging activity of DPPH free radicals

2.3 ABTS自由基清除能力

由圖3可知，樣品中游離酚和結合酚對ABTS具有清除效果，隨樣品量增大ABTS清除率增強。清除ABTS強弱順序為藍色小麥、紫色小麥、普通小麥。

a-游離酚;b-結合酚圖3 ABTS自由基清除能力Fig.3 Scavenging activity of ABTS free radicals

當小麥質量濃度在40 mg/mL時，游離酚ABTS清除率依次為：(55.2±2.4)%、(51.5±2.3)%、(43.8±1.9)%，藍色小麥和紫色小麥的IC50值分別為：36.3、40.1 mg/mL；結合酚對ABTS清除率依次為：(30.3±2.5)%、(29.1±2.6)%、(30.2±2.3)%。3組樣品中游離酚對ABTS的清除效果強于結合酚。

2.4 超氧陰離子清除能力

超氧陰離子參與機體中生物大分子的氧化損傷反應，過多的超氧陰離子產生強氧化性，易引起機體損傷造成慢性疾病[25-26]。由圖4可知，樣品中游離酚和結合酚對超氧陰離子均有清除作用，隨樣品量增大超氧陰離子清除能力增強。清除超氧陰離子強弱順序為藍色小麥、紫色小麥、普通小麥。當小麥質量濃度在40 mg/mL時，藍色小麥、紫色小麥及普通小麥游離酚超氧陰離子清除率依次為：(40.3±1.9)%、(32.0±2.1)%、(23.0±1.7)%；結合酚清除率依次為：(57.3±2.5)%、(53.1±2.6)%、(50.3±2.2)%，IC50值依次為：30.7、35.8、38.8 mg/mL。3組樣品中的結合酚對超氧陰離子表現更強的清除作用。

a-游離酚;b-結合酚圖4 超氧陰離子清除能力Fig.4 Scavenging activity of superoxide free radicals

2.5 羥自由基清除能力

羥自由基的電子能力強，過量的羥自由基會促進細胞氧化，會誘導細胞毒性產生致癌作用。減少此類自由基可預防心血管疾病。研究發現，植物酚類的多羥基具有供電子能力，能夠清除羥自由基或阻斷Fenten反應，減少羥自由基的產生量[27]。如圖5所示，樣品中游離酚和結合酚對羥自由基均有清除作用，隨樣品量增大其清除能力增強。清除羥自由基強弱順序為藍色小麥、紫色小麥、普通小麥。當小麥質量濃度在40 mg/mL時，藍色小麥、紫色小麥及普通小麥的游離酚羥自由基清除率依次為：(51.1±2.1)%、(44.0±2.4)%、(38.2±1.8)%，藍色小麥IC50值為41.8 mg/mL；結合酚的羥自由基清除率依次為：(88.5±1.8)%、(82.1±1.7)%、(80.0±1.5)%，其IC50值依次為：9.9、12.7、14.5 mg/mL。3組樣品結合酚的IC50值均低于游離酚，說明結合酚對羥自由基的清除效率高于游離酚。以上結果與Min等[31]的研究結論一致。

a-游離酚;b-結合酚圖5 羥自由基清除能力Fig.5 Scavenging activity of hydroxy free radicals

2.6 總還原力清除能力

研究發現還原能力與抗氧化能力密切相關，還原能力可作為抗氧化評價指標。具有還原能力的物質利用氫質子將體系中鐵離子還原，從而起到抑制自由基產生，而酚類具有提供氫質子的能力[28]。如圖6所示，樣品均表現出一定的還原能力，在700 nm下隨樣品量增大吸光度逐漸上升。清除總還原力強弱順序為藍色小麥、紫色小麥、普通小麥。當小麥質量濃度在40 mg/mL時，藍色小麥、紫色小麥及普通小麥游離酚的總還原力依次為：(0.200±0.003)、(0.149±0.004)、(0.143±0.003)；結合酚的還原力依次為(0.188±0.003)、(0.186±0.002)、(0.181±0.003)。3組樣品結合酚和游離酚的還原效果接近，說明游離酚和結合酚的還原能力差異不明顯，與NAYAK等[5]的研究結論較一致。

a-游離酚;b-結合酚圖6 總還原能力Fig.6 Reducing power

3 結論

本研究對藍色和紫色小麥中的游離酚及結合酚進行提取并評價其抗氧化能力。研究發現藍色和紫色小麥中酚類含量豐富，樣品中結合酚含量高于游離酚，總酚含量表現為：藍色小麥>紫色小麥>普通小麥。體外抗氧化研究表明，樣品中游離酚和結合酚對DPPH自由基及ABTS自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基、總還原力均具有較好的清除效果，酚含量與抗氧化效果呈正相關，但游離酚和結合酚對不同自由基清除效果存在差異。抗氧化能力整體表現為藍色小麥優于紫色小麥優于普通小麥。本試驗可為彩色小麥作為保健食品開發利用提供參考依據。