以酒糟為基質的高溫型生物有機肥復合發酵菌劑的制備

楊新，楊雙全，陳莉*，盧紅梅，周蓮，楊華連

1(貴州大學，貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽，550025) 2(貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽，550025) 3(貴州大學 化學與化工學院，貴州 貴陽，550025)

白酒糟是白酒生產過程中產生的固體廢棄物，我國是白酒生產大國，2015年我國白酒產量達1 312.8萬kL，2016年達1 358.4萬kL，同比增長3.5%[1]。每生產1 t的白酒，就會產生6～10 t的酒糟[2]，按白酒與酒糟1∶8的質量比計算，2016年酒糟達10 000萬t。鮮酒糟因其產量大,不易貯藏與運輸，目前主要是做廢棄物處理或經晾曬后用作粗飼料，但由于價格低廉，經濟效益不夠明顯，造成了資源的巨大浪費和對周圍環境的嚴重污染[3]。酒糟本身由于發酵不完全等原因，仍存有較高的粗纖維、粗灰分、無氮浸出物、粗淀粉、粗蛋白和微量元素等營養物質[4]，可廣泛應用于飼料、醫藥、食品等工業[5-7]。而利用酒糟為原料制作生物有機肥，既能解決環保問題，又可為綠色食品的生產提供有機環境，是實現酒糟的大規模資源化利用的有效途徑[8-9]。

生物有機肥是指特定功能微生物與以動植物的殘骸(如農作物秸稈、家禽糞便等)為主要原料，經過無害化處理達到腐熟的有機物料復合而成的既具有微生物肥效又具有有機肥肥效的新型肥料，它不僅無污染、無公害，而且還適用于發展綠色食品[10]。生物有機肥發酵菌劑多由2種或2種以上的微生物按照一定的比例復合配制而成，在堆肥過程中形成優勢菌群，它們之間相互聯合協調發揮各自的功能，從而促進堆肥的進程，提高堆肥質量，以實現堆肥快速腐熟的一種微生物菌劑[11]。對新型發酵菌劑的研制主要集中在對農牧業產生的秸稈、糞便和生活有機垃圾等處理方面，以及各種食品生產過程中產生的下腳料處理[12-14]。林金新等[15]以白酒丟糟為主要原料，4種芽孢桿菌、2種霉菌與釀酒酵母為混菌發酵菌株，發酵后腐殖質含量達到17.50%，種子發芽指數(GI)值達到93.2%，E4/E6值為2.19；曹建蘭等[14]利用白酒丟糟發酵生產生物有機肥，證明接種功能微生物對酒糟進行二次發酵，生產生物有機肥的方法是可行的，并設計出兩步發酵制備酒糟型生物有機肥的新工藝。隨著生物技術的快速發展，微生物菌劑因其高效、無污染等優點被越來越多的人關注和使用[16-19]。

高溫菌較常溫菌具有更高的微生物代謝活性和有機物降解速率[20]，在廢棄物處理領域具有廣泛的應用前景。因此研制高溫型菌劑，提高堆肥質量迫在眉睫，而對于高溫型生物有機肥復合發酵菌劑的研究目前還少見報道。本試驗首先對篩選的高溫菌株做拮抗性試驗，然后分別制備各菌株的單菌劑，同時結合前期研究的生長特性和降解特性，確定合理的高溫菌株復配方案以及復配比例。復配后以一定的接種比例接種到酒糟中進行小規模試驗，以堆肥腐熟的各項指標為響應值來確定高溫發酵菌劑的最優配比。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

菌種：前期課題組從醬香型白酒糟堆積中分離出來的7株高溫優勢菌，分別命名為DX[地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)]、XX[空氣芽孢桿菌(Bacillusaerius)]、DF[產色高溫單孢菌(Thermomonosporachromogena)]、M1[微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)]、M4[嗜熱籃狀菌(TalaromycesthermopHilus)]、M5[黑曲霉(Aspergillusniger)]以及M6[腫梗根毛霉(Rhizomucortauricus)]，其中M5和M6的最適生長溫度為40 ℃，DX、XX和M1的最適生長溫度為45 ℃，M4的最適生長溫度為50 ℃，DF的最適生長溫度為55 ℃。

可溶性淀粉、NaOH(分析純)，天津市永大化學試劑有限公司；營養瓊脂、牛肉膏(BR)，北京奧博星生物技術有限責任公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、高氏一號培養基、蛋白胨(BR)，上海博微生物科技有限公司；酒糟,取自仁懷市茅臺鎮某酒廠第7輪次拋糟的醬香型酒糟；生石灰,購于興安縣福陽礦業有限公司；麩皮,過0.9 mm篩，某面粉廠提供。

高氏一號培養基[21]；營養瓊脂培養基[22]；PDA培養基[23]。以上培養基配制好后均調為pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

麩皮固體載體：稱取一定量的麩皮，加入60% 的無機鹽溶液，均勻攪拌后，靜置潤料30 min，稱取50 g潤料完畢的麩皮加入250 mL三角瓶中，包扎，121 ℃滅菌20 min，冷卻后打散結塊的麩皮以備用。

無機鹽溶液：KNO31.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，K2HPO4·3H2O 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L。

1.1.2 主要儀器設備

ESJ220-4B電子天平，沈陽龍騰電子有限公司；SN-CJ-IF潔凈工作臺、YXQ-LS-5DS11立式壓力蒸汽滅菌器、BSC-150恒溫恒濕箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；DHG-9140B(101-2B)智能型電熱恒溫鼓風干燥箱、SPX-250B智能型生化培養箱，上海瑯玕實驗設備有限公司；CH2043微電腦電磁爐，中山市格蘭仕生活電器制造有限公司；SHZ-82A恒溫振蕩器，常州澳華儀器有限公司；HYG-A全溫搖瓶柜，金壇市盛藍儀器制造有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗性試驗

采用平板對峙法。取在平板上活化好的各菌株，將7種菌兩兩交叉劃線接種于普通營養瓊脂培養基上[3]，在50 ℃恒溫恒濕培養箱中培養3 d，觀察十字交叉處是否有被抑制而發生菌落萎縮和消失的現象，從而判斷各菌株之間是否有拮抗性。

1.2.2 單菌劑制備

(1)細菌、放線菌單菌劑的制備：挑取平板上活化好的菌株1環，接種到250 mL營養瓊脂或PDA(細菌接種到營養瓊脂；放線菌接種到PDA)液體培養基中，放入全溫搖床柜中，45 ℃、120 r/min培養12～36 h(細菌培養12 h，放線菌培養36 h)至菌株進入對數生長期。然后吸取10 mL液體菌劑，加入麩皮固體載體中，45 ℃培養8 h，讓麩皮載體充分吸收菌體。最后將培養好的菌劑于45 ℃的烘箱中烘12～24 h，即可得到細菌、放線菌的單菌劑。

(2)霉菌單菌劑的制備：挑取活化好的霉菌1環接種于麩皮中，45 ℃培養，待三角瓶內麩皮結成餅后，進行扣瓶，繼續培養24 h，即可得到菌劑。然后將菌劑按10%的接種量加入麩皮固體載體中，混合均勻，再將其均勻地平鋪在滅菌的瓷盤中，物料厚1～2 cm。用滅過菌的8層紗布覆蓋后在45 ℃恒溫恒濕培養箱中培養，每隔12 h在紗布上灑少許的無菌水，總共培養48 h。最后將培養好的菌劑于45 ℃的烘箱中烘12～24 h，即可得到霉菌的單菌劑。

(3)菌劑有效活菌數測定：將固體培養物放在恒溫鼓風干燥箱中45 ℃條件下烘至恒重，用粉碎機打散混勻后，稱取10 g置于裝有玻璃珠和100 mL生理鹽水的250 mL三角瓶中，以200 r/min振蕩30 min，得到基礎液；對細菌、霉菌和放線菌單菌劑，采取10倍稀釋法分別稀釋至10-9，最后3個連續的稀釋梯度取0.1 mL分別涂營養瓊脂、PDA、高氏一號平板，每個梯度做3個平行試驗，且3種平板都各設置一組涂無菌水的平板作對照。最后單菌劑有效活菌數以平均值表示，復合菌劑的活菌數以數量級最大的數表示。

1.2.3 菌劑復配及條件優化

分別取7株單菌劑按有效活菌數大致為1∶1∶1∶1∶1∶1∶1的比例，按10%的接種量接種到裝有500 g預處理過酒糟(即酒糟10.00 g,生石灰0.25 g,無菌水7.00 mL,麩皮3.00 g，并攪拌均勻)的2 L大燒杯中，攪拌均勻后在燒杯口用8層滅過菌的紗布覆蓋，自然堆肥，每隔8 h測堆體溫度，當溫度達到最高時，測其中各菌株的自然比例。

有效菌株確定后，結合拮抗性試驗，充分考慮各菌株的特點，同時參考各菌株在預處理過的酒糟中的自然比例(表5)，選取細菌DX、XX，霉菌M1、M4、M5、M6和放線菌DF七株功能菌來構建復合菌劑，菌株的構建主要考慮各單菌劑的適宜配比。以菌株DX、XX、M1、M4、M5、M6和DF分別作為Plackett-Burman試驗的7個因素，每個因素取高、低2個水平，因素水平表見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素及編碼(n=12)Table 1 Plackett-Burman test design factors andcoding (n=12)

根據各菌株在酒糟中的自然比例的基礎上，選取菌株DX、XX、M1、M4、M5、M6和DF為試驗因素，按照Plackett-Burman試驗設計了12組方案將單菌劑復配成12組復合菌劑，Plackett-Burman試驗設計方案見表2。

表2 Plackett-Burman試驗設計方案 單位：g

菌劑構建后效果的考察主要以菌劑接入酒糟共同處理酒糟的效果為主，同時與現有菌劑(市場上生產的堆肥菌劑：J13和J14)進行對比。分別從12組復合菌劑和2組現有菌劑(J13和J14)中取50 g，加入裝有500 g預處理過酒糟的2 L大燒杯中，攪拌均勻后在燒杯口用8層滅過菌的紗布覆蓋，將接種有12組復合菌劑的酒糟放入50 ℃的生化培養箱，接種有J13和J14菌劑的酒糟根據其菌劑的最適條件于室溫下用泡沫保溫，自然發酵。同時設置2個對照組J15和J16(J15放入50 ℃的生化培養箱，J16放入室溫條件中并用泡沫保溫)，對照組不加任何菌劑，其余條件相同。每天分別用無菌玻璃棒攪拌一次，前4 d每隔24 h向堆體中撒入少量蒸餾水，以保持堆體的濕度，待堆體中長出大量菌絲即停止灑水。以顏色變化、氣味變化、含水率(R1)、電導率(EC)、pH值、A665nm(腐殖酸在波長665 nm處吸光值)、有效活菌數(R2)、種子發芽指數(GI)為堆肥質量考察指標，7 d后測量，判斷各菌劑的堆肥效果和腐熟程度，從而選取菌劑的最優復配方法。

1.2.4 含水率的測定

采用105 ℃恒溫干燥法稱取新鮮堆肥樣品30 g,精確至0.001 g，放入事先稱好質量的錫箔紙盒(m0)中，稱重記為m1，將裝有樣品的錫箔紙盒放入105 ℃烘箱中烘干至恒重，然后稱重記為m2。每組樣品設3個重復，3組數據的平均值作為該樣品的值。樣品含水率(wH2O)的計算公式：

(1)

1.2.5 pH值、電導率和A665nm的測定

取新鮮堆肥樣品,用蒸餾水按樣水比1∶10(g∶mL)，在室溫條件下，于水浴振蕩器下水平振蕩提取30 min后，用pH計直接測定pH值；用電導率儀測電導率(EC)；用分光光度計測A665nm。每組樣品設3個重復，3組數據的平均值作為該樣品的值。

1.2.6 種子發芽率(GI)的測定

稱取新鮮堆肥樣品10 g于100 mL去離子水中，于25 ℃下振蕩30 min后過濾，吸取10 mL濾液加入鋪有3層濾紙的干凈培養皿中，然后在濾紙上均勻播種50粒水蘿卜種子，設置3組平行。對照組為蒸餾水，置于25 ℃培養箱中，黑暗培養48 h。以胚根長度達到與種子等長，胚芽長度達到種子長度1/2作為是否發芽的標準。種子發芽指數(GI)按公式(2)計算：

(2)

1.3 數據處理

采用Origin 8.6、Excel 2016和Design-Expert 8.0等軟件對實驗數據進行處理，每個處理組進行3次平行試驗。

2 結果與分析

2.1 菌株間拮抗性試驗

拮抗性試驗是為了防止在復配菌劑的時候菌種之間產生拮抗作用，影響微生物活性，進而影響堆肥效率的提升。對各菌株在固體平板上進行拮抗性試驗，兩兩交叉處無菌落萎縮或消失現象，結果(表3)表明，各菌株之間均無拮抗作用，彼此都能在同一環境下良好生長，可以用于混菌發酵實驗。這可能是在平板劃線篩選優勢菌的時候就挑取了無拮抗現象的優勢菌。

表3 50 ℃下的7株優勢菌的拮抗試驗結果Table 3 Antagonistic experiment results of 7 dominantbacteria at 50 ℃

注：“+”表示有拮抗性，“-”表示無拮抗性。

2.2 單菌劑的制備

制備的固體單菌劑中有效活菌數如表4所示。

表4 固體單菌劑中有效活菌數Table 4 The effective number of living bacteria in solidsingle agent

由表4可知，各種固體單菌劑除了DF和M4外，有效活菌數均達到億/g級，尤其是菌劑XX達到了1010CFU/g，表明制備的每一種單菌劑里面的有效活菌數都比較高。

2.3 菌劑復配

2.3.1 各菌株在酒糟中的自然比例

各高溫菌株DX、XX、M1、M4、M5、M6、DF在預處理過的酒糟中自然堆肥，當溫度達到最高時，根據各菌株的菌落形態特征，采用平板計數法得到各菌株含量,如表5所示。

表5 各菌株在酒糟中的菌落數Table 5 The number of colony of strains in vinass

通過對表5中各菌株的酒糟中的菌落數換算，各單菌劑的質量分別為：DX 1.5 g,XX 1.5 g,M1 2.5 g,M4 2.5 g,M5 1.0 g,M6 2.5 g,DF 8.0 g。

2.3.2 堆肥7d后各工藝參數

(1)顏色變化。堆肥7 d后，空白對照組J15、J16，顏色未發生變化，市購組J13、J14和實驗組J1～J12在堆肥7 d后顏色由灰褐色變成黑褐色，堆體顏色稍微加深，但實驗組之間區別不大。由此可看出，對于以酒糟為堆肥原料，用顏色來評價其腐熟程度是無法定量的。

(2)氣味變化。空白對照組J15在堆肥7 d后,酒糟味基本消失，這很可能是由于J15處于一個50 ℃的高溫、通風環境中，堆體中原本的酒糟味逸散出來，從而使酒糟味變淡，空白對照組J16氣味未發生變化。市購組J13、J14和實驗組J1～J12在堆肥7 d后氣味由酒糟味變成略微泥土霉味和氨味，有泥土霉味可以初步判斷堆體已初步腐熟，而氨味是堆體分解蛋白質釋放出來的氨氣未完全逸散出去，是由于堆體發酵空間較小，攪拌通風效果不是很理想。但實驗組之間氣味區別不大，由此可看出，對于以酒糟為堆肥原料，用氣味來評價其腐熟程度也是無法定量的，可考慮使用氣相色譜儀進行定量分析，但用于生產實際過于麻煩，因此依靠氣味也無法判斷各組菌劑優劣程度，只能初步判定各組菌劑對于酒糟的腐熟是起作用。

(3)含水率。水分是反應微生物活躍程度的重要因素之一，微生物強烈代謝會大量消耗水分，并且使堆肥的溫度升高，水分快速蒸發，從而使水分急劇減少[24]。由圖1可知，添加了菌劑的實驗組J1～J12和市購組J13、J14，在堆肥7 d后含水率較空白對照組J15、J16都低，且都在30%左右。較其他文獻豬糞堆肥結束有一定差異[25]，可能跟堆肥的原料、通風情況等有關。由此可知，添加了菌劑的堆肥，由于菌劑帶來的大量微生物的產熱以及劇烈活動,有利于堆體水分的擴散，從而使堆體中含水率降低。

圖1 各組堆肥含水率情況Fig.1 The water content of compost in each group

(4)電導率(EC)。電導率(EC)反映的是堆肥浸提液中的可溶性鹽含量，主要由有機酸類和無機鹽組成，同時反映了堆肥浸提液對植物毒害的大小，因此電導率的變化反映了堆肥的腐熟程度[26]。一般認為，堆肥的電導率<9.0 ms/cm，不會對種子發芽產生抑制作用[27]。由圖2可知，添加了菌劑的實驗組J1～J12和市購組J13、J14的堆肥，在堆肥7 d后,J1～J12的電導率小于市購組J13、J14小于對照組J15和J16，且均低于9 ms/cm，由此可看出實驗組J1～J12均達到堆肥腐熟的標準。

圖2 各組堆肥電導率情況Fig.2 The conductivity of compost in each group

(5)pH值。物料酸堿度是影響微生物生命活動的重要因素之一[28]。通常腐熟的堆肥一般呈弱堿性，pH值在8～9左右，但是由于pH值也受堆肥原料和條件的影響，一般作為堆肥腐熟的一個必要條件，而非充分條件[29]。由圖3可知，實驗組J1～J12和市購組J13、J14的pH值均在8～9之間，符合堆肥腐熟的必要條件[30]。微生物發酵先經過一個產酸過程，堆體中產生有機酸，pH呈下降趨勢；同時含氮有機物分解產生氨，逐漸增加累積引起pH值升高。而對照組J15、J16的pH值未發生較大變化。

圖3 各組堆肥pH值情況Fig.3 The pH value of compost in each group

(6)吸光度值(A665nm)。A665nm與腐殖酸的含量變化相關，因此可用來作為堆肥腐殖化程度的參考指標。一般腐熟堆肥的A665nm<0.008[31]。由圖4可知，添加了菌劑的實驗組J1～J12和市購組J13、J14在堆肥7 d后，與對照組J15、J16相比，A665nm值均大幅度降低，除了J1、J8和J12組外，其他11組的A665nm均<0.008，達到腐熟標準。

圖4 各組堆肥A665nm值情況Fig.4 The E665 value of composte in each group

(7)有效活菌數。由表6可知，添加了菌劑的實驗組J1～J12和市購組J13、J14在堆肥7 d后，有效活菌數均達到109CFU/g，遠超生物有機肥對于顆粒劑型0.20×108CFU/g標準[32]。而且實驗組J1～J12菌劑的活菌數均比市購組J13、J14高，其中最高的為實驗組J7,達到了85.32×108CFU/g，是J14的2.65倍多、J13的1.88倍多，可見在以酒糟為堆肥原料時，本試驗研究的菌株在其中的生長活性遠超菌劑J13和J14。

表6 各組堆肥有效活菌數目Table 6 The number of effective living bacteria ineach group

(8)種子發芽指數(GI)。植物生長的生物量能夠表征堆肥的腐熟度，因為未腐熟堆肥會產生植物毒性物質抑制植物的生長，而腐熟堆肥則會促進其生長，種子發芽指數(GI)可以反映堆肥產品對植物的毒性。因此種子發芽指數(GI)是評價堆肥腐熟度的一個指標，考慮到堆肥產品最后用于農業生產中，故植物生長試驗應是評價堆肥腐熟度的最終和最具說服力的方法。現在普遍認為：當GI>50%時，就可以認為堆肥中有毒物質的含量降低到了植物可以承受的范圍；當GI≥85%時，表示堆肥已經完全腐熟[8, 33-34]。由表7可知，添加了菌劑的實驗組J1～J12和市購組J13、J14在堆肥7 d后，種子發芽指數(GI)均超過50%，達到基本腐熟，其中J4組和J7組的GI值≥85%，可說明完全腐熟。而空白對照組J15、J16的種子發芽指數(GI)在10%左右，可見酒糟腐熟是由于菌劑的添加降低了植物有毒物質的含量，且本試驗研究的菌劑略優于菌劑J13和J14，說明添加外源微生物菌劑能夠明顯加速腐熟發酵進程。目前國內外評價有機固體廢棄物腐熟度較為公認的指標為種子發芽指數(GI)，因為GI值可綜合體現堆肥樣品的低毒性或高毒性，高毒性和低毒性分別影響種子發芽和根的生長，因此GI被認為最敏感、最可靠、最有效和最能反映堆肥產品植物毒性和判斷堆肥無害化和腐熟度參數。

表7 各組堆肥種子發芽指數Table 7 The seed germination index in each group

以種子發芽指數GI為響應值，利用Design Expert 8.0對J1～J12的Plackett-Burman試驗數據進行分析，經整理后如表8。

經軟件主效分析，XX(P=0.003 7)、M5(P=0.025 9)的效應顯著，P值均<0.05，可見XX、M5這2株菌株對于堆肥后種子發芽指數影響顯著，其中XX是正影響，M5是負影響。其他4種菌株對種子發芽指數(GI)影響不太大。

表8 Plackett-Burman試驗主效應分析Table 8 Main effect analysis of Plackett-Burmanexperiment

注：*表示0.05水平上的差異。

3 結論

本試驗以種子發芽指數(GI)為主要評價指標，結合顏色、氣味、含水率、pH值、電導率、吸光度值、有效活菌數等為輔助評價指標，以Plackett-Burman試驗設計方案，得到J7組菌劑為最優菌劑，最優質量配比為：m(DX)∶m(XX)∶m(M1)∶m(M4)∶m(M5)∶m(M6)∶m(DF)=1.0∶2.0∶3.0∶3.0∶0.5∶2.0∶6.0，該菌劑有效活菌數為85.32×108CFU/g，種子發芽指數(GI)為86%。且該高溫復合菌劑在堆肥的有效活菌數以及種子發芽指數(GI)方面優于市售高溫菌劑J13和J14，說明該高溫復合菌劑促進了堆體的腐熟效果。酒糟經過高溫復合菌劑堆積發酵之后可以提高肥效，制備成為優質生物有機肥，這對加強酒糟資源的綜合利用，改善環境污染，促進白酒產業的健康持續發展都有著積極的作用。