遮蔭處理對葛根光合及抗氧化特性的影響

吳瀟，何秀娟，吳超，董玉鋒，張燕，徐宇，秦衛東，呂俊，王三根*，宗學鳳*

(1.西南大學農學與生物科技學院，重慶 400715；2.富葛實業葛根研究中心，重慶 402385)

葛根(Puerarialobata)是豆科蝶形花亞科多年生草質藤本植物，種質資源豐富，分布廣泛，全世界有葛屬(Pueraria)植物約20種。我國是葛屬植物的中心產地，共有11種[1]。野生葛根內含約12%的黃酮類化合物，如葛根素、大豆苷、大豆苷元等成分，還有蛋白質、氨基酸、糖和鐵、鈣、銅、硒等礦物質，有解肌退熱，透疹，生津止渴，升陽止瀉的功效，是國家衛生計生委公布的藥食兩用植物[2]，葛根的嫩莖和葉片適口性好，也是優良飼料來源[3]。

耐陰性是植物在弱光條件下所表現出的繼續生存的能力，由植物自身的遺傳因素和對外界光照條件變化的適應性兩個方面決定[4]。光是影響植物生長、存活和分布的重要生態因子，光對植物最直接的作用是光合作用，提供同化力形成所需要的能量，光照強度變化直接導致光合特性及植株代謝的變化[5-6]。葉綠素熒光參數是常用評價光合器官的功能和環境壓力影響的重要參數，它可以反映植物葉片光合作用光系統對光能的吸收、傳遞、耗散和分配等，因此通過對葉綠素熒光特性的研究可以了解植物的生長和受脅迫的生理狀態[7-8]。Yang等[9]研究發現適度遮蔭可顯著提高羊草(Leymuschinensis)的光合色素含量、提升光合效率，改善葉綠素熒光特性，但嚴重遮蔭則對植株生長產生很大影響。

植物在不同光照條件下，不僅光合生理發生變化，其生長、代謝以及抗氧化特征也發生改變。如Wang等[10]研究發現遮蔭在引起甘薯 (Ipomoeabatatas) 光合特性變化時，其內源激素、生長與產量也發生變化。眾多研究還表明，植物在遮蔭情況下，通過抗氧化系統的響應來應對弱光逆境的脅迫，如保持細胞膜的完整性，防止膜脂過氧化作用，提高超氧化物岐化酶等抗氧化酶活性，提升滲透調節能力[9,11]。由于細胞電導率、丙二醛的含量、抗氧化酶酶活性、脯氨酸等滲透調節物質的含量往往會隨著遮蔭程度的變化而相應變化，因而成為研究遮蔭條件下植株抗性與生理響應的重要指標[11-12]。

葛根是陽生植物，在野外以匍匐型居多，常成片生長于向陽坡面上[13]，但生產栽培中則要求葛根植株呈直立狀態，且密度增加，其光、溫、水等生態環境與野外相比有很大的不同，如植株之間的相互影響導致光照強度降低。研究不同光強對葛根光合與抗氧化特性的影響對于指導生產實踐中植物的栽培、立體配置具有重要的現實意義。不同遮蔭處理對植株生長的效應已經有較多報告[14]，相關研究在葛根中未見，基礎研究還很薄弱，因而本試驗通過設置不同光照強度的處理，探討遮蔭度對葛根的影響及其機制，以期為葛根引種栽培及逆境生理研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

實驗材料采自西南大學歇馬鎮葛根育苗基地。其生長地屬亞熱帶季風性氣候，19°51′ N，106°37′ E，雨量充沛，年降水量1203 mm，年日照時數1006.2 h，年平均氣溫18.4 ℃，>10 ℃的年積溫為3066 ℃。本實驗于2016年5-11月進行。葛根育苗至8到9葉時，選取長勢一致的健康葛根幼苗移栽，用黑色遮陽網搭設遮蔭棚。利用不同層數的遮陽網對其進行遮蔭處理，設相對光強為全光照的100%(T1)、75%(T2)和50%(T3)3個處理，每處理6個重復；每天上午與下午監測各處理的光照強度，以確保試驗條件的一致性。不同處理小區遮蔭棚間隔寬5 m，以避免交叉遮蔭，四周通風。

1.2 測定指標

葛根各處理生理指標測定均取相同葉位的相同部位。光合色素含量測定采用Wellburn[15]法。光合作用的測定采用Li-6400便攜式光合儀，選擇配備紅藍光源的2 cm×3 cm標準葉室，光合有效輻射(photosynthetically active radiation，PAR)為1000 μmol·m-2·s-1，CO2濃度(CO2concentration, Ca)為400 μmol·mol-1。不同生長期光合作用測定時間均為上午10：00-11：30；光合作用日變化全天測定6次，即8:00、10:00、12:00、14:00、16:00和18:00。測定指標主要包括：凈光合速率(net photosynthetic rate,Pn)、胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration,Ci)、氣孔導度(stomatal conductance,Gs)、蒸騰速率(transpiration rate,Tr)，每次測定6個葉片，取平均值。采用Li-6400配備熒光葉室6400-40測定葉片熒光特性，上午10：00開始測定，指標包括：初始熒光(minimal fluorescence,F0)、最大熒光(maximal fluorescence,Fm)、可變熒光(variable fluorescence,Fv)、光合效率潛能(optimal/minimal quantum yield of PSⅡ,Fv/F0)、最大光化學效率(optimal/maximal quantum yield of PSⅡ photochemistry,Fv/Fm)和PSⅡ實際光化學效率(PSⅡ actual photochemical efficiency, ΦPSⅡ)，每次測定6個葉片，取平均值。

葛根抗氧化特性取各處理植株相同部位葉片測定。采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量[16]；采用考馬斯亮藍G-250法測定可溶性蛋白質含量[17]；采用茚三酮比色法測定游離氨基酸[18]。參照硫代巴比妥酸比色法[19]測定丙二醛的含量；電導率儀測定葉片電導率。采用李忠光等[20]的單一系統提取方法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、過氧化物酶(peroxidase, POD)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)酶活性。準確稱取樣品加入預冷的提取液3 mL和少許石英砂，充分冰浴研磨后，轉入離心管中，再用2 mL提取液洗研缽，合并提取液并于4 ℃下，離心20 min，將上清液分裝，分別進行酶活性測定。

1.3 數據統計

采用Excel 2007對記錄數據進行統計分析，SPSS 15.0進行單因素方差分析和多重比較，數據用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 不同遮蔭處理對葛根光合特性的影響

由表1可知，遮蔭處理顯著增加了葛根葉綠素a、葉綠素b含量、類胡蘿卜素含量和光合色素總量，且以處理T3含量最高。葉綠素a/b值則隨遮蔭度的增加而減小，且較T1而言，差異達到顯著水平。方差分析結果表明：遮蔭處理可以有效提高葛根葉片葉綠素a、葉綠素b含量、類胡蘿卜素含量和光合色素總量，而降低葛根葉片葉綠素a/b值。

葉綠素a和葉綠素b含量變化有類似的趨勢，以T3含量最高。且在同一處理隨時間的動態變化中，兩者的含量均呈現先增后減，葉綠素a在45 d時含量最高，葉綠素b在T2、T3遮蔭強度下在45 d時含量最高，而T1在60 d時含量最高。葉綠素a含量在30 d時，3種光照強度下的含量相互之間存在顯著性差異，T1和T3光照條件下含量在整個遮蔭過程中都存在顯著性差異；葉綠素b含量在45 d時，3種光照強度下含量相互之間都存在顯著性差異。葉綠素b的增加幅度比葉綠素a的更大一些。

類胡蘿卜素含量隨著遮蔭程度的增加不斷增加，且均在60 d時表現出最大值。在同一處理隨時間的動態變化中，其含量基本呈現先增后減的趨勢，在遮蔭后45 d內，類胡蘿卜素含量有一些微升，在45～60 d時含量迅速增加，基本增加為30～45 d的4倍，在60～75 d其含量又有所下降，但仍比30～45 d的含量高。葉綠素a/b的含量隨遮蔭強度的增加整體表現出減小的規律。在同一處理隨時間的動態變化中亦是如此。T1和T2、T1和T3遮蔭強度下的葉綠素a/b的值之間存在顯著性差異，但T2和T3下其含量沒有顯著性差異。這可能與葉綠素b在45～60 d時含量增大幅度有關。T1條件下，在30 d時葉綠素a/b的值最大；T3條件下，在45 d時葉綠素a/b的值最小。

葉綠素總量隨著遮蔭程度的增加而增加，T3含量最高。在同一處理隨時間的動態變化中，其含量總體呈現先增后減的趨勢。在T1和T2條件下葉綠素總量在45 d時出現最大值，在T3下其含量在60 d時出現最大值；在60 d內時T1和T3、T1和T2條件下的葉綠素總量存在顯著性差異。在60～75 d時只有T1和T3下的含量存在顯著性差異。

表1 不同遮蔭處理葛根光合色素含量變化Table 1 Changes of photosynthetic pigment content under different shading treatments in P. lobata

注:同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: Different letters in the same column mean significant different at 0.05 level, the same below.

葛根葉片凈光合速率(Pn)日變化趨勢呈雙峰型曲線，兩個峰值均出現在10:00和14:00。總體而言，遮蔭降低了葛根葉片凈光合速率。比較同一時間各處理葉片凈光合速率，表明除14:00時處理T1(100%光照)外，各時間點凈光合速率均表現為T1>T2>T3。14:00時處理T1凈光合速率低于處理T2和T3，這可能與全光照條件下光抑制有關。比較同一時間各處理葉片胞間CO2濃度，可以看出隨著遮蔭度的增加，葛根葉片胞間CO2濃度(Ci)呈上升趨勢。各處理胞間CO2濃度(Ci)最低值均出現在14：00，胞間CO2濃度(Ci)各時間點總體表現為T1T2>T3。各處理峰值均出現在14:00左右，說明強光有利于葛根葉片氣孔的開放。比較同一時間各處理葉片蒸騰速率，可見隨著遮蔭度的增加，葛根葉片蒸騰速率(Tr)總體上呈下降趨勢，為T1>T2>T3。處理T2和T3為單峰型曲線，在10:00達到峰值。處理T1呈雙峰型曲線，在10:00和14:00達到峰值。說明在強光條件下，遮蔭能夠減緩葛根葉片蒸騰作用(表2)。

由表3可知，隨著遮蔭度的增加，葛根葉片F0、Fm、Fv、Fv/F0、Fv/Fm和ΦPSⅡ均隨之升高。處理T3各項葉綠素熒光參數均顯著高于處理T1。處理T2各葉綠素熒光參數中，除F0和Fv/Fm與處理T1達到顯著差異水平外，其余參數均與處理T1差異不顯著；而T3各項指標與T1均呈現顯著性差異。

2.2 不同遮蔭處理對葛根抗氧化特性的影響

研究表明，在遮蔭條件下，葛根可溶性糖、蛋白與游離氨基酸含量均表現出顯著的下降趨勢，表明弱光逆境不利于這些物質的積累。其中葛根可溶性糖含量在整個生長期均隨遮蔭程度的增加而減小，以T1含量最高。而同一處理中可溶性糖的動態變化則均呈先增后減的趨勢，且以處理后45 d含量最高(表4)。葛根可溶性蛋白含量在整個生長期均隨遮蔭程度的增加而減小，以T1含量最高。而同一處理中可溶性蛋白的動態變化則呈先增后減的趨勢，且以處理后60 d含量最高(表5)。葛根游離氨基酸含量在整個生長期同樣均隨遮蔭程度的增加而減小，且以T1含量最高。而同一處理中游離氨基酸的動態變化也同樣隨時間呈先增后減的趨勢，且以處理后60 d含量最高(表6)。

表2 不同遮蔭處理葛根光合作用日變化Table 2 Daily changes of photosynthesis under different shading treatments in P. lobata

表3 不同遮蔭處理葛根葉綠素熒光參數的變化Table 3 Changes of chlorophyll fluorescence parameters under different shading treatments in P. lobata

表4 不同遮蔭處理葛根可溶性糖含量的變化Table 4 Changes of soluble sugar content under different shading treatments in P. lobata (mg·g-1)

表5 不同遮蔭處理葛根可溶性蛋白含量的變化Table 5 Changes of soluble protein content under different shading treatments in P. lobata (mg·g-1)

表6 不同遮蔭處理葛根游離氨基酸含量的變化Table 6 Changes of free amino acids content under different shading treatments in P. lobata (mg·g-1)

表7 不同遮蔭處理下葛根丙二醛含量的變化Table 7 Changes of malondialdehyde content under different shading treatments in P. lobata (nmol·g-1)

表8 不同遮蔭處理下葛根葉片電導率的變化Table 8 Changes of leaf conductivity under different shading treatments in P. lobata (%)

表9 不同遮蔭處理對葛根抗氧化酶活性的影響Table 9 Effects of different shading treatments on antioxidant enzyme activity in P. lobata

研究表明，遮蔭對葛根膜脂過氧化作用與膜透性以及抗氧化酶活性有極大影響。從表7可以看出，膜脂過氧化產物丙二醛的含量隨遮蔭程度的增加而增加，以T3含量最高。同一處理隨時間的動態變化中，丙二醛含量先減后增，且以60 d最低。由表8可知，葉片電導率隨遮蔭程度的增加而增加，以T3含量最高。同一處理隨時間的動態變化中，葉片電導率總體趨勢先減后增，同樣以60 d最低。方差分析結果表明：遮蔭處理降低了葛根葉片滲透調節物質的含量，而導致葛根葉片的丙二醛含量和電導率的增大。由表9可知，葛根5種抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、谷胱甘肽還原酶(GR)酶活性隨著遮蔭程度的增加均呈下降趨勢。除谷胱甘肽酶(GR)活性外，其余4種抗氧化酶活性在處理間均達到顯著差異。說明遮蔭條件可以顯著降低葛根抗氧化酶系統活性。

3 討論

自然條件下，植物在它的整個生命周期中都要經歷不同程度的環境變化，不同光強對植物生長代謝影響很大[21-22]。野生葛根常成片生長于向陽坡面上，但在引種栽培中由于立體配置等其光照條件會發生改變，本研究表明此時葛根的光合特性及抗氧化特性會發生顯著變化。

葉綠素是植物葉片進行光合作用過程中吸收光能的主要物質，主要包括葉綠素a，葉綠素b和類胡蘿卜素。因此，葉片中光合色素是植物進行光合作用的前提，其含量的高低是反映植物葉片光合能力的一個重要指標[23-24]。在一定范圍內植物對光環境有一定的適應能力，很多植物在弱光下會合成大量的葉綠素以捕獲更多的光能，但在不同光反應類型中的品種間存在差異[23,25]。在本實驗中，從不同遮蔭處理葛根光合色素含量的變化特征來看，在一定范圍內，隨著遮蔭強度的上升，葛根葉片中的葉綠素a，葉綠素b，類胡蘿卜素和葉綠素總量都呈現上升的趨勢，但葉綠素a/b值不斷下降。說明在遮蔭實驗中葛根葉綠素b的生物合成較其他葉綠素有更大的增大程度，葉綠素b是耐陰色素，它的增加對保持較大比例的捕光色素有很大優勢，使得葛根葉片可以吸收更多的光能[9]。梁鎮林等[25]的研究顯示，隨著遮蔭強度的增加，大豆(Glycinemax)幼苗葉片中的各種葉綠素含量均有較大增加，且以葉綠素b含量增加更為明顯。鄭堅等[26]通過遮蔭對降香黃檀(Dalbergiaodorifera)生長和生理特性研究表明，一定的遮蔭處理可提高降香黃檀光合色素含量和CO2同化速率，本研究結果與此一致。

光合速率也是植物代謝水平高低的標志之一，在逆境條件下光合速率的提高能增強植物對逆境的抵抗能力。凈光合速率是決定植物碳同化、干物質積累的關鍵因素，是衡量植物生產力水平的可靠指標之一[27-28]。不同遮蔭條件下，植株的生長與光合特性均有很大變化[29-30]。凈光合速率(Pn)由氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)和胞間CO2濃度(Ci)等共同決定。本實驗中遮蔭條件下葛根葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)和蒸騰速率(Tr)減小，胞間CO2濃度(Ci)提高。遮蔭條件下葛根葉片凈光合速率(Pn)減小，說明遮蔭降低了葛根葉片光合能力。由于中午強光高溫的抑制作用，凈光合速率曲線為雙峰型；氣孔導度(Gs)直接影響植物光合和蒸騰作用，遮蔭下葛根光合特性的這些變化應該引起關注[31]。

葉綠素熒光參數是表征植物光合生理性狀的重要指標[32-33]。F0和Fm是植物受到環境脅迫的重要標志，初始熒光強度(F0)是表征激發光強度和葉綠素含量的重要指標，當PSⅡ受到損傷，F0會明顯升高[34]。本試驗中，F0隨著遮蔭度的增加而升高，且各處理間差異顯著，說明遮蔭對葛根葉片PSⅡ的損傷程度達到顯著差異。劉俊祥等[35]認為，植物Fv/Fm對環境脅迫較為敏感，其值大小也可反映植物受傷害的程度。本試驗中，處理T1(100%光照)的Fv/Fm值顯著低于處理T2(75%光照)和T3(50%光照)，說明遮蔭對葛根產生了顯著的光脅迫。實際光化學效率(ΦPSⅡ)反映了在光照條件下反應中心部分關閉的情況下的實際原初光能捕獲效率，表示光化學反應消耗的能量比例。本研究顯示，隨著遮蔭度的增大，ΦPSⅡ值提高。處理T3顯著高于處理T1和T2，表明遮蔭條件下葛根葉片捕獲的光能用于光化學反應的比例提高。本試驗研究發現，遮蔭導致葛根葉片F0、Fm、Fv、Fv/Fm和ΦPSⅡ增加，與張云等[36]研究結果相似。

植物還會通過改變物質代謝變化來應對光照強度的變化[12,37-39]。弱光環境下，植物的生理代謝及生理指標會發生改變，丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、脯氨酸和可溶性糖等滲透調節物質的含量也會隨著遮蔭程度的變化而相應改變[14,40-41]。本實驗中可溶性糖含量隨遮蔭程度的增加而減少，與郭巧生等[42]對藥用白菊花(Chrysanthemummorifolium)的研究，周興元等[43]對假儉草(Eremochloaophiuroides)的研究及肖艷輝等[44]對茴香(Foeniculumvulgare)植株生長的研究結果一致。在隨時間的動態變化中，葛根可溶性糖含量先增后減，在處理45 d后其生長最為旺盛，養分積累最多；而可溶性蛋白和游離氨基酸含量在處理60 d后達到最高峰，說明此時葛根的代謝狀況良好[45]。丙二醛(MDA)是植物在逆境脅迫下膜脂過氧化作用的最終產物，其含量可以反映植物遭受逆境傷害程度；電導率是膜透性變化的重要指標之一，與逆境脅迫程度和植物抗逆性強弱有關[14,41]。本實驗在對葛根細胞膜系統的研究中，表明隨遮蔭程度的增加，葛根在弱光逆境受到的傷害也加劇。

有研究表明，植物自身建立起多種保護適應機制對抗外界光環境的變化，比如光照過強時，植物通過降低葉綠體活動來減少光能吸收和激活一系列酶促和非酶促反應以消除體內活性氧[46]?？寡趸缚梢杂行宄参矬w內自由基，使植物體內自由基含量保持動態平衡。郭巧生等[42]研究認為，在一定遮蔭程度上隨著膜脂過氧化作用的加劇，藥用白菊花葉片的抗氧化能力也在降低；楊妤等[47]認為，遮蔭降低了銀杏(Ginkgobiloba)幼苗SOD和POD活性。本試驗與其研究結果一致，葛根抗氧化酶系統活性隨遮蔭程度增加而降低，且活性最高時MDA含量和葉片電導率最低，說明弱光脅迫會降低葛根的抗氧化能力。但也有一些研究結果與之不一致，如喬勻周等[48]對缺苞箭竹(Fargesiadenudata)和青楊(Populuscathayana)衰老葉片的研究發現遮蔭后其葉片的SOD活性顯著高于對照。造成研究結果相悖的原因可能是不同物種對弱光的耐受性有別。由此可見，在葛根引種栽培不斷發展的情況下，遮蔭對葛根生理特性的改變機理值得進一步研究[49]。

4 結論

綜合以上，遮蔭下葛根的光合特性及抗氧化特性發生改變，嚴重遮蔭對葛根的生長造成一定的弱光脅迫，不利于陽生植物葛根的正常生長發育。葛根在全日照條件下的各生理特征方面都表現出較高的水平，而隨著遮蔭程度的增加，其各個光合作用與抗氧化指標有較大的下降趨勢。因此在引種栽培中要防止光照強度過低對葛根的不利影響，注意通過改善引種栽培的環境條件，提高光合效率，提升滲透調節物質含量與抗氧化酶活性，調控其抗氧化性能，合理搭配水肥調控，以促進葛根生長。