T- SPOT.TB對(duì)塵肺并發(fā)結(jié)核感染的早期診斷價(jià)值

黃鵬，肖祖克，徐燁(、宜春市人民醫(yī)院感染科，江西宜春6000；、江西省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江西南昌0006；、宜春市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西宜春6000)

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T- SPOT.TB對(duì)塵肺并發(fā)結(jié)核感染的早期診斷價(jià)值

黃鵬1，肖祖克2，徐燁3
(1、宜春市人民醫(yī)院感染3科，江西宜春336000；2、江西省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江西南昌330006；3、宜春市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西宜春336000)

摘要:目的探討血T-SPOT.TB對(duì)于塵肺并發(fā)結(jié)核感染的早期診斷價(jià)值。方法納入病例共96例，根據(jù)最終診斷結(jié)果分為塵肺結(jié)核組、塵肺組、肺結(jié)核組。使用血T-SPOT.TB、結(jié)核抗體、痰抗酸桿菌涂片、痰抗酸桿菌培養(yǎng)4種方法對(duì)三組研究對(duì)象進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)比4種方法的診斷價(jià)值。結(jié)果四種方法檢測(cè)塵肺結(jié)核組的敏感度分別為91.4%、40%、20%、25.7%，其中T-SPOT.TB敏感度（91.4%）最高，和其他三種方法相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01）；四種方法檢測(cè)單純肺結(jié)核組的敏感度分別為93.7%、46.8%、31.2%、34.3%，T-SPOT.TB和其他三種方法相比，差異也有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01），兩組T-SPOT.TB陽性檢出率均明顯高于塵肺組（P值均＜0.01），而T-SPOT.TB在塵肺結(jié)核組與單純肺結(jié)核組的敏感度無明顯差異（P值＞0.05）。四種檢測(cè)方法的陰性預(yù)測(cè)值分別為83.3%、38.7%、36.7%、38.1%，其中T-SPOT.TB陰性預(yù)測(cè)值（83.3%）最高，和其他三種方法相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01）。結(jié)論血T-SPOT.TB對(duì)塵肺并發(fā)結(jié)核感染具有高敏感度、高陰性預(yù)測(cè)值的特點(diǎn)，有助于塵肺并發(fā)結(jié)核感染的早期診斷。

關(guān)鍵詞：T-SPOT.TB；塵肺；結(jié)核；診斷

塵肺病是我國目前發(fā)病人數(shù)最多、危害最為嚴(yán)重的一種職業(yè)病，不僅損害患者的精神及身體健康，還給社會(huì)發(fā)展和穩(wěn)定帶來一定的影響。結(jié)核感染是塵肺病人的常見并發(fā)癥之一，而我國又是結(jié)核高負(fù)擔(dān)國家，因此，塵肺并發(fā)結(jié)核感染受到越來越多結(jié)核病專科醫(yī)師的關(guān)注。粉塵和結(jié)核分枝桿菌的雙重作用改變了塵肺與結(jié)核兩個(gè)病各自原有的特征，塵肺結(jié)核在影像及病理學(xué)上表現(xiàn)復(fù)雜，給臨床診斷帶來了很大的困難。目前診斷結(jié)核病的方法有結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(tuberculin skin test，TST)、結(jié)核抗體檢測(cè)等，但這些方法檢測(cè)靈敏度和特異性較低[1，2]。結(jié)核感染T淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB）以結(jié)核桿菌早期分泌性抗原靶-6（ESAT-6）和培養(yǎng)濾液蛋白-10 （CFP-10）為抗原，ESAT-6和CFP-10選自結(jié)核分枝桿菌基因組差異區(qū)1 (region of difference，RD1)基因編碼的結(jié)核桿菌特異性蛋白，為結(jié)核桿菌所特有，在卡介苗和絕大部分環(huán)境分枝桿菌中都缺少，可在結(jié)核病人中誘發(fā)淋巴細(xì)胞分泌γ干擾素(γ-interferon，IFN-γ)的免疫應(yīng)答，這些產(chǎn)生IFN-γ的T細(xì)胞可被極其敏感的ELISPOT方法檢測(cè)到，可應(yīng)用于結(jié)核病的早期診斷。目前已廣泛應(yīng)用于臨床[3]。塵肺并發(fā)結(jié)核感染較單純肺結(jié)核更為復(fù)雜，T-SPOT.TB在診斷塵肺并發(fā)結(jié)核感染時(shí)是否具有高靈敏度和特異性尚不明確。本文旨在探討血T-SPOT.TB用于塵肺并發(fā)結(jié)核感染的早期診斷價(jià)值。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2014年7月至2015年9月于江西省宜春市人民醫(yī)院傳染科、呼吸內(nèi)科和江西省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科就診的塵肺合并結(jié)核感染患者、塵肺患者、單純肺結(jié)核患者共96例，分為3組，其中塵肺結(jié)核組35例，塵肺組29例，肺結(jié)核組32例。所有均無肺結(jié)核及肺外結(jié)核病史，并排除慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴(kuò)張等基礎(chǔ)疾病。三組在年齡、性別等資料上比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)⑴塵肺診斷標(biāo)準(zhǔn)按照中國職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中的《塵肺病診斷標(biāo)準(zhǔn)》，經(jīng)江西省職業(yè)病防治所診斷專家小組進(jìn)行確診，并有診斷鑒定證書。⑵肺結(jié)核、塵肺并發(fā)結(jié)核感染的診斷按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行：1）實(shí)驗(yàn)室診斷：痰液、支氣管鏡刷片或灌洗液結(jié)核分枝桿桿菌涂片陽性；病理檢查可見典型的結(jié)核改變(如干酪樣壞死)；2）臨床診斷：①有結(jié)核病接觸病史；②近期出現(xiàn)有低熱、盜汗、咯血、消瘦等結(jié)核臨床表現(xiàn)；③影像學(xué)提示團(tuán)片塊狀影短期內(nèi)顯著增大、增多，且出現(xiàn)空洞，肺內(nèi)結(jié)節(jié)病灶短期內(nèi)增多，存在支氣管播散病灶；④結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)強(qiáng)陽性；⑤常規(guī)抗炎治療2周無效，經(jīng)抗結(jié)核治療1月后好轉(zhuǎn)，并跟蹤隨訪，最終確診為結(jié)核感染。⑶塵肺組的診斷按以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行：1）動(dòng)態(tài)觀察影像學(xué)無明顯變化；2）隨訪3個(gè)月無結(jié)核臨床表現(xiàn)；3）經(jīng)抗炎治療后病灶吸收好轉(zhuǎn)，臨床確診為炎癥，排除結(jié)核感染。

1.3檢測(cè)方法T－SPOT.TB檢測(cè)：采用英國Oxford Immunotec公司生產(chǎn)的T－SPOT.TB試劑盒。采集研究對(duì)象4ml靜脈血。加入肝素鈉抗凝的采血管內(nèi)，用淋巴細(xì)胞分層液分離、提純單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2.5×106/L。每個(gè)血液測(cè)試樣本需要用到4個(gè)檢測(cè)孔：在陰性對(duì)照孔內(nèi)加入細(xì)胞培養(yǎng)液50μl；在陽性質(zhì)控對(duì)照孔內(nèi)加入陽性對(duì)照PHA50μl；在2個(gè)測(cè)試孔內(nèi)分別加入結(jié)核分枝桿菌混合多肽A即ESAT－6抗原和混合多肽B即CFP－10抗原各50μl。分別在上述孔內(nèi)加入100μl 2.5× 106/L的PBMC。將微孔板放入(37±1)℃含5%CO2培養(yǎng)箱中孵育16～20h。經(jīng)PBS洗板4次后，加入新鮮配制的標(biāo)記抗體工作液50μl，于4℃孵育1h。再次PBS洗板4次，加入顯色底物溶液50μl，于室溫中顯色反應(yīng)7min，用雙蒸水洗滌各孔終止反應(yīng)。在孔內(nèi)可見有深藍(lán)色清晰的斑點(diǎn)，將微孔板避光放在通風(fēng)環(huán)境下或37℃溫箱中干燥。應(yīng)用美國CTL公司酶聯(lián)斑點(diǎn)讀取分析儀計(jì)數(shù)著色的斑點(diǎn)。

結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：若陰性對(duì)照孔的斑點(diǎn)數(shù)小于10，且陽性對(duì)照孔的斑點(diǎn)數(shù)大于20，說明試驗(yàn)成功。A、B實(shí)驗(yàn)孔，達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)則判定為陽性結(jié)果：①當(dāng)陰性對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)為0～5時(shí)，A、B孔中任意一孔斑點(diǎn)數(shù)減去陰性對(duì)照孔后大于等于6，結(jié)果判斷為陽性；②當(dāng)陰性對(duì)照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)為6～10時(shí)，A、B孔任意一孔斑點(diǎn)數(shù)大于陰性對(duì)照的2倍，結(jié)果判斷為陽性。如果上述標(biāo)準(zhǔn)不符合且陽性對(duì)照孔正常時(shí)檢測(cè)結(jié)果為陰性。

1.4統(tǒng)計(jì)分析將入選的患者所有臨床資料及檢測(cè)結(jié)果輸入Excel表，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，應(yīng)用SPASS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1四種檢查方法的敏感度分析四種方法檢測(cè)塵肺結(jié)核組的陽性檢出率分別為91.4%、40%、20%、25.7%，其中T－SPOT.TB（91.4%）最高，和其他三種方法相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01）（表1）；四種方法檢測(cè)單純肺結(jié)核組的陽性檢出率分別為93.7%、46.8%、31.2%、34.3%，TSPOT.TB和其他三種方法相比，差異也有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01）（表1），兩組T－SPOT.TB陽性檢出率均明顯高于塵肺組（P值均＜0.01），而TSPOT.TB陽性檢出率在塵肺結(jié)核組與單純肺結(jié)核組之間無明顯差異（P值＞0.05）。

表1　四種檢查方法的陽性結(jié)果比較（%）

2.2四種檢查方法的特異性分析四種檢測(cè)方法的特異性分別為86.2%、82.8%、100%、100%，其中T－SPOT.TB的特異性86.2%，和其他三種法相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05）（表2）。

表2　四種檢查方法的特異性比較

2.3四種檢查方法的陽性預(yù)測(cè)值分析四種檢測(cè)方法的陽性預(yù)測(cè)值分別為93.9%、85.2%、100%、100%，T－SPOT．TB和其他三種方法相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05）（表3）。

表3　四種檢查方法的陽性預(yù)測(cè)值比較

2.4四種方法的陰性預(yù)測(cè)值分析四種檢測(cè)方法的陰性預(yù)測(cè)值分別為83.3%、38.7%、36.7%、38.1%，其中T－SPOT.TB陰性預(yù)測(cè)值（83.3%）最高，和其他三種方法相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01）（表4）。

表4　四種檢查方法的陰性預(yù)測(cè)值比較

3　討論

塵肺病人并發(fā)結(jié)核感染的概率大約是無粉塵接觸人群的3～10倍[4，5]。塵肺合并結(jié)核感染由于粉塵和結(jié)核分枝桿菌的雙重打擊，對(duì)肺組織的免疫損傷更為復(fù)雜，對(duì)肺功能的損害不是二者簡(jiǎn)單的疊加，而是二者相互促進(jìn)，嚴(yán)重影響預(yù)后，使治療效果明顯下降，病死率和致殘率明顯升高。因此，早期診斷塵肺結(jié)核并給予早期治療對(duì)于患者的預(yù)后有著十分重大的意義。我們都知道，肺結(jié)核確診的金標(biāo)準(zhǔn)是痰涂片抗酸染色找到結(jié)核分枝桿菌或痰培養(yǎng)見結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)。但是，這兩種方法的陽性率很低，而且痰培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌的時(shí)間較長(zhǎng)，通常至少需要2～8周甚至更長(zhǎng)的時(shí)間才有結(jié)果[6]。因此這兩種方法均不適合用于塵肺并發(fā)結(jié)核感染的早期診斷。傳統(tǒng)的診斷方法如結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(TST）、血清結(jié)核抗體等都可用于檢測(cè)結(jié)核疾病[7－13]，但其敏感性和特異度不盡相同。TST的不足之處是與卡介苗有相似的抗原，容易與其他的非致病性分枝桿菌成分發(fā)生交叉感染，陽性率會(huì)出現(xiàn)較大波動(dòng)，影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。因此TST并不能真實(shí)反應(yīng)我國人群結(jié)核菌感染的真實(shí)情況。Ling等[14]研究發(fā)現(xiàn)TST受環(huán)境、機(jī)體免疫力狀況等多重因素的影響，診斷敏感度和陰性預(yù)測(cè)值都比較低。而且目前用于TST的試劑較為短缺，臨床應(yīng)用受限。使用ELISA法進(jìn)行結(jié)核抗體檢測(cè)不能區(qū)分是急性結(jié)核感染還是既往感染過結(jié)核，免疫力低下的患者或使用免疫抑制劑等情況下，結(jié)核相關(guān)抗體可能會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，且其陽性率往往隨病程的延長(zhǎng)而增加，對(duì)早期診斷幫助不大[15]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR）、基因芯片技術(shù)等分子生物學(xué)診斷技術(shù)使結(jié)核的診斷得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。PCR技術(shù)敏感性高，與常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)相比，陽性率平均高出了17.4%[16]。但由于標(biāo)本易受到污染、且不能區(qū)別死菌與活菌，目前PCR技術(shù)尚不完善，方法也未規(guī)范化，而且實(shí)驗(yàn)條件的要求也較高，因此其早期診斷價(jià)值還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。基因芯片技術(shù)是將微電子技術(shù)和微加工技術(shù)兩者結(jié)合起來，一起應(yīng)用在固體芯片表面來組成微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，從而獲取細(xì)胞、DNA、RNA等生物組分相關(guān)信息。該種技術(shù)雖然簡(jiǎn)單快速，所需要的標(biāo)本量較少，檢測(cè)過程也比較快，但生物芯片的制作過程比較復(fù)雜，對(duì)其檢測(cè)設(shè)備的要求較高加之檢測(cè)成本較高，因此該項(xiàng)技術(shù)難以得到廣泛普及應(yīng)用。綜上所述，目前塵肺患者合并結(jié)核分枝桿菌感染的早期診斷難度很大，需要一種靈敏性和特異性都較好的輔助檢查手段來提高診斷率。

干擾素釋放試驗(yàn)采用ELISA/ELISPOT(酶聯(lián)免疫吸附/酶聯(lián)免疫斑點(diǎn))方法定量檢測(cè)檢測(cè)全血/外周血單核細(xì)胞在結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激下釋放γ－干擾素的水平，用于檢查結(jié)核分枝桿菌潛伏性感染以及診斷結(jié)核病，其特異性要明顯高于結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)[17]。T－SPOT.TB于2005年在美國被批準(zhǔn)用于結(jié)核感染的輔助診斷。國外研究報(bào)道（非結(jié)核高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)）T－SPOT.TB檢測(cè)的敏感性為90%，特異性為93%[18]，是篩查和檢查結(jié)核病的重要方法。在結(jié)核高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)，Kang等[19]進(jìn)行的一項(xiàng)前瞻性研究結(jié)果顯示T－SPOT.TB檢測(cè)的敏感性為92%，特異性為47%，陽性預(yù)測(cè)值60%，陰性預(yù)測(cè)值87%；相對(duì)比TST敏感性為68%，特異性51%，陽性預(yù)測(cè)值55%，陰性預(yù)測(cè)值64%。本次研究通過觀察T－SPOT.TB在塵肺并發(fā)結(jié)核感染中的敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值，評(píng)價(jià)其臨床應(yīng)用價(jià)值。我們對(duì)塵肺結(jié)核組35例、塵肺組29例、單純肺結(jié)核組32例患者進(jìn)行T－SPOT. TB檢測(cè)，塵肺結(jié)核組陽性率為91.4%（32/35），而傳統(tǒng)方法血清結(jié)核抗體陽性率為40%（14/35），痰涂片抗酸染色陽性率為20%（7/35），痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的陽性率為25.7%（9/35）。塵肺組T－SPOT. TB陽性率為13.8%（4/29），ELISA法檢測(cè)血清結(jié)核抗體、痰涂片抗酸染色、痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的陽性率分別為17.2%（5/29）、0%（0/29）、0%（0/29）。肺結(jié)核組陽性率分別為93.7%、46.8%、31.2%、34.3%。由此可見，T－SPOT.TB診斷結(jié)核感染的高度敏感性，較其他三種方法有明顯優(yōu)勢(shì)（P均＜0.01），與國外報(bào)道一致。而T－SPOT.TB陽性檢出率在塵肺結(jié)核組與單純肺結(jié)核組之間無明顯差異（P值＞0.05），說明塵肺并不會(huì)對(duì)T－SPOT.TB診斷結(jié)核感染造成影響。塵肺組29例患者中有25例T－SPOT.TB呈陰性，其特異性為86.2%（25/29），血清結(jié)核抗體、痰涂片抗酸染色、痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的特異性分別為82.8%(24/29)、100%（29/29）、100%（29/29），我們可以看到T－SPOT.TB有較高的特異性（86.2%），但和其他三種方法相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）。而四種方法的陽性預(yù)測(cè)值分別為93.9%、85.2%、100%、100%，T－SPOT.TB和其他三種方法相比亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）。可見細(xì)菌學(xué)檢查仍是結(jié)核感染診斷治療最可靠的標(biāo)準(zhǔn)，痰涂片抗酸染色、痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)特異度高，能夠作為塵肺并發(fā)結(jié)核感染的確診依據(jù)，因此具有相當(dāng)高的臨床價(jià)值。但其敏感性較差，本研究中痰涂片抗酸染色、痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的敏感度分別只有20%和25.7%，其原因可能是結(jié)核感染病灶被塵肺纖維化所包裹，支氣管有不同程度的壓迫、狹窄、阻塞等，不利于結(jié)核分枝桿菌的排出。另外，痰涂片抗酸染色和痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)都不能作為潛伏期結(jié)核感染篩查的方法，故而在臨床中的應(yīng)用受到一定程度的限制。盡管在特異性上T-SPOT.TB較其他三種方法無明顯優(yōu)勢(shì)，但TSPOT.TB的特異性仍較高，而其靈敏度則高達(dá)91.4%，證明T-SPOT.TB用于塵肺并發(fā)結(jié)核感染的診斷具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究中T-SPOT. TB陰性預(yù)測(cè)值為83.3%，血清結(jié)核抗體、痰涂片抗酸染色、痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的陰性預(yù)測(cè)值分別為38.7%、36.7%、38.1%，T-SPOT.TB陰性預(yù)測(cè)值最高，和其他三種方法相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.01），與Zhou等[20]報(bào)道基本一致，證明T-SPOT.TB檢測(cè)高度的陰性預(yù)測(cè)值對(duì)于塵肺患者排除結(jié)核感染也具有較高的臨床意義。

綜上所述，結(jié)核感染T淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（TSPOT.TB）具有高敏感性、高陰性預(yù)測(cè)值的特點(diǎn)，特異性、陽性預(yù)測(cè)值與ELISA法檢測(cè)血清結(jié)核抗體、痰涂片抗酸染色、痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)這幾個(gè)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室方法相當(dāng)，可用于塵肺并發(fā)結(jié)核感染的早期臨床診斷。

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·檢驗(yàn)與臨床·

(收稿日期2015-12-10；修回日期2016-02-04)

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.02.025

中圖分類號(hào)：R153.2，R521.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-1129(2016)02-0201-04