重癥支氣管哮喘患者外周血RASSF1A甲基化水平及相關(guān)因素的作用

(核工業(yè)四一六醫(yī)院 1.重癥醫(yī)學(xué)科, 2.呼吸內(nèi)科， 四川 成都 610051；3.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院東院檢驗(yàn)科，四川 成都 610101)

支氣管哮喘作為一種起病較慢的炎癥性疾病，患者臨床上主要變現(xiàn)為氣道慢性炎癥及對各種刺激因素呈高反應(yīng)性[1]。我國支氣管哮喘患病率為12%左右，近年來其患病率又呈增高趨勢[2]。哮喘發(fā)病的危險因素包括遺傳因素、肥胖，吸煙、寵物飼養(yǎng)等相關(guān)因素[3]。支氣管哮喘不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，而且還有可能對社會經(jīng)濟(jì)造成直接或間接的負(fù)擔(dān)以及影響。有研究結(jié)果提示Ras相關(guān)區(qū)域家族1A(Ras association domain family member-1，RASSF1A)的基因啟動子甲基化與肺癌的發(fā)生存在較為明顯的關(guān)聯(lián)，但其是否會于支氣管哮喘存在相互依存的分子機(jī)理通路尚未知[4,5]。故本研究就重癥支氣管哮喘患者外周血RASSF1A甲基化水平及相關(guān)因素進(jìn)行了初步分析和討論。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集本院2011年5月至2016年5月期間收治的重癥支氣管哮喘患者138例，所有病例均已經(jīng)確診；同期隨機(jī)抽取140例已排除肺部疾患的健康體檢樣本作為對照組。血標(biāo)本的采集和流行病學(xué)相關(guān)資料的問卷調(diào)查均由醫(yī)生或?qū)I(yè)調(diào)查員在征得受試者知情同意后采集。重癥支氣管哮喘的診斷與納入標(biāo)準(zhǔn)參考：(1) 反復(fù)發(fā)作的哮喘氣急以及胸悶或咳嗽，可見接觸變應(yīng)原,冷空氣,刺激物或病毒感染等；(2) 哮喘發(fā)作時雙肺可聞及散在或彌漫性的哮鳴音, 特別是以呼氣相為主，可見呼氣相延長；(3) 癥狀常可經(jīng)治療緩解，也可自行緩解；(4) 除外其他疾病所引起的哮喘,以及氣急胸悶和咳嗽等癥狀表現(xiàn)；(5)不典型者至少滿足以下幾種情況之一：出現(xiàn)支氣管激發(fā)試驗(yàn)或運(yùn)動試驗(yàn)陽性支氣管舒張?jiān)囼?yàn)陽性，出現(xiàn)晝夜PEF變異率高于百分之而是。凡是符合第一至第四條或第四和第五條者，可診斷為支氣管哮喘; 重癥者見于短時間出現(xiàn)呼吸困難明顯，可見端坐呼吸甚至紫紺、行動困難；一般支氣管擴(kuò)張藥不能消除哮喘；兩肺聞及廣泛哮鳴；同時實(shí)驗(yàn)室檢查作為輔助檢查：肺通氣功能檢查，可見一秒鐘用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值的60%～70%；動脈血氧分壓明顯下降，以及二氧化碳分壓正常或升高；酸堿度值常見正常或略下降。

1.2 RASSF1A基因甲基化的PCR檢測分析

采用實(shí)時熒光定量甲基化特異PCR(Real-time methylation specific PCR)技術(shù)對RASSF1A基因的甲基化水平進(jìn)行檢測。本研究對外周血DNA 樣本中的甲基化水平進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)的分析、處理采用SPSS16.0，采用卡方檢驗(yàn)對定性資料進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對于定量資料采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析，相關(guān)因素分析借助Logistics回歸模型完成, 以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者基本特征

本研究中納入的病例組138名(男性68名)受試平均年齡54.28歲，對照組140名(男性71名)，平均年齡52.99歲，兩組基本情況可比。病例組的BMI指數(shù)和二手煙史者比例稍高于對照組，超重/肥胖比例、既往吸煙比例以及有哮喘家族史者均明顯高于對照組。詳見表1所示。

表1 研究對象基本特征比較 (例，%)

與對照組比較，aP<0.05,bP<0.01

2.2 不同BMI狀態(tài)的病例組和對照組RASSF1A啟動因子甲基化率

本研究中支氣管哮喘病例組中發(fā)現(xiàn)2例RASSF1A啟動因子甲基化增高，甲基化率為1.45%,，對照組未見甲基化增高的受試，其中病例組中男性RASSF1A啟動因子甲基化率為1.47%，女性為1.45%，無性別差異，詳見表2。比較不同BMI水平的兩組受試的甲基化率，進(jìn)行組間比較以及不同性別和BMI狀態(tài)之間的比較發(fā)現(xiàn)，偏瘦的男女性 RASSF1A啟動因子甲基化率均較高，男女之間又以男性更高。如表2所示。

表2 不同BMI狀態(tài)的病例組和對照組RASSF1A啟動因子甲基化率比較 (%)

與對照組比較，aP<0.05；與男性比較，bP<0.05

2.3 不同吸煙/二手煙狀態(tài)的病例組和對照組RASSF1A啟動因子甲基化率

比較不同吸煙狀態(tài)的受試RASSF1A啟動因子甲基化率情況，如表3所示，分析結(jié)果提示吸食二手煙的男性和女性RASSF1A啟動因子甲基化率顯著高于其他受試，其中吸食二手煙的女性高于男性。

表3 不同吸煙/二手煙狀態(tài)的病例組和對照組RASSF1A啟動因子甲基化率比較 (%)

與對照組比較，aP<0.05；與男性比較，bP<0.05

2.4 RASSF1A啟動因子甲基化及相關(guān)因素與成年人支氣管哮喘之間關(guān)聯(lián)

綜合分析RASSF1A啟動因子甲基化及相關(guān)因素與成年人支氣管哮喘之間關(guān)聯(lián)，多因素Logistic回歸分析結(jié)果提示RASSF1A啟動因子甲基化增高與成年人支氣管哮喘之間的OR值為1.388(1.189-1.619), 此外偏瘦和二手煙吸食史也為潛在危險因素，OR值分別為1.055和1.338。見表4。

表4 RASSF1A啟動因子甲基化及相關(guān)因素與成年人支氣管哮喘之間關(guān)聯(lián)的回歸分析

3 討 論

近年來表觀遺傳學(xué)逐漸引起相關(guān)研究者的關(guān)注，其在基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的背景下，探討基因表達(dá)的可遺傳變化。其中的DNA甲基化(DNA methylation)是眾多表觀遺傳的現(xiàn)象中的一種常見表現(xiàn)，除了DNA的甲基化變化以外，基因組印記、基因沉默、休眠轉(zhuǎn)座子激活和RNA編輯均為表觀遺傳學(xué)探索的范疇。DNA的甲基化是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5′碳位共價鍵結(jié)合一個甲基基團(tuán)，即形成了DNA的甲基化狀態(tài)[6]。人類基因組的CpG二核苷酸在正常情況下大多是處于甲基化狀態(tài)的，且數(shù)量稀少[7]。人類基因組序列分析結(jié)果提示CpG島的數(shù)目與基因密度相互對應(yīng)，因此DNA甲基化的發(fā)生與發(fā)育和腫瘤的關(guān)系非常密切，特別是CpG島出現(xiàn)甲基化增高往往與抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活有關(guān)[8]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)哮喘的發(fā)生不僅與環(huán)境密切關(guān)聯(lián)，而且也和遺傳因素密不可分，特別是對哮喘與肺癌二者之間存在獨(dú)立關(guān)聯(lián)[9]。RASSF1A最初是在研究小細(xì)胞肺癌的過程中被發(fā)現(xiàn)并關(guān)注的，其為Ras相關(guān)區(qū)域家族1中的一員，位于3號染色體的短臂上[10]。近年來研究報道提示RASSF1A 基因啟動子甲基化頻繁還與其他多種腫瘤以及疾病有關(guān)，而這種甲基化的改變可以方便地從外周血及體液、喉漱洗液中檢測出來，取材方便低創(chuàng)，所以正在作為新的疾病診斷標(biāo)志物而成為現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)病例組超重/肥胖比例、既往吸煙比例以及有哮喘家族史者均明顯高于對照組，說明肥胖、吸煙及家族史會增加重癥支氣管哮喘的風(fēng)險，其原因可能是肥胖及吸煙人群肺功能負(fù)擔(dān)過重[12]。觀察不同患者RASSF1A啟動因子甲基化率結(jié)果發(fā)現(xiàn)，偏瘦的男性更高；吸食二手煙的男性和女性顯著高于其他受試，其中吸食二手煙的女性高于男性,提示ASSF1A啟動因子甲基化可能與重癥支氣管哮喘之間存在潛在關(guān)聯(lián)。這與Schmiemann V[13]等人的研究結(jié)果相似。多因素Logistic回歸分析結(jié)果提示除了RASSF1A啟動因子甲基化增高、偏瘦和二手煙吸食史是影響成人支氣管哮喘的獨(dú)立危險因素。其原因可能是加速肺功能的損害程度，同時可降低患者對吸入治療的敏感性以及對常規(guī)激素治療的反應(yīng)狀態(tài),會阻礙哮喘治療的效能[14]。

綜上所述，RASSF1A啟動因子甲基化增高、偏瘦和二手煙吸食史是影響成人支氣管哮喘的獨(dú)立危險因素，這為哮喘預(yù)防及治療提供重要意義。