串聯質譜檢測苯丙氨酸濃度在篩選新生兒苯丙酮尿癥中的應用

(西安交通大學第一附屬醫院兒科, 陜西 西安 710000)

新生兒疾病篩查是指對新生兒進行先天性疾病及遺傳性疾病進行群體篩檢，以保障兒童正常的體格和智能發育。苯丙酮尿癥(phenylketonuria,PKU)是一種常染色體隱性遺傳代謝性疾病，是由于體內苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hydroxylase, PAH)活性降低導致苯丙氨酸向酪氨酸代謝受阻，從而導致患兒智力低下和生長發育緩慢。在我國，患兒苯丙酮尿癥的發病率已達0.01%[1]，已列為新生兒常規檢查項目之一。苯丙酮尿癥可被治療，通過對新生兒開展主要疾病篩查工作，進而提高治愈率，以防止嚴重后果的發生[2-3]。而MS/MS是一種靈敏度和特異性均很高的快速分析法, 可實現樣本中多種目的樣的同時測定，并且能夠將診斷的假陰性和假陽性率大大降低。本文主要研究MS/MS在篩查新生兒苯丙酮尿癥中的效果，現將結果整理如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2011年3月至2015年12月共采集標本9000例，健康新生兒組男6000例，女2998例，共8998例，臨床疑似PKU患者2例。(Phe和Tyr的正常值范圍是通過檢測健康嬰幼兒血中PHe和Tyr的濃度來確定的。)臨床表現為智力相對于健康嬰兒偏低。按《新生兒疾病查技術規范》[4]采集樣本。標本來源于出生大于3天，哺乳至少達到3次的嬰兒，于足跟部采血，用專用濾紙收集采集到的血樣，自然干燥，然后將其置于塑料袋內，為保證不被污染需將其進行封口并保存于-20 ℃冰箱中于一周內檢驗即可。

1.2 儀器和試劑

PKU 檢測指標為新生兒干濾紙血片樣本中的Phe和Tyr濃度，采用MS/MS檢驗分析法，所用的高效液相色譜串聯質譜儀購自美國Applied Biosystems公司，型號為3200QTRAP。MS/MS所用到的非衍生化試劑盒購自美國Millipore公司。實驗中所用到的Phe和Tyr標準品均來自美國sigma公司。

1.3 MS/MS法

測定前先用打孔器將采血濾紙打成3 mm的圓形濾紙，將其置于96孔板中，每孔加入用Phe和Tyr同位素標記的甲醇溶液100 L，密封，45 ℃以650轉/分鐘的速度振蕩50 min，室溫放置30 min后轉移80 L置于另一個新的96孔板中上樣檢測。檢測時將自動進樣設置為每次進樣20 L，測定時選擇多反應監測模式，每個樣品的測試時間約為2 min。

1.4 資料分析

采用定量分析軟件ChemoView1.0, 根據Phe 和Tyr同位素標記和離子峰強度，根據標準品做出標準曲線，然后再計算出相應樣品Phe和Tyr的濃度。

1.5 結果判定

通過檢測健康新生兒血液中Phe和Tyr濃度，并根據本科室檢測的具體情況，將新生兒樣本干濾紙血片中的 Phe 濃度陽性切值定為120 mol/L，同時Phe/Tyr的比值要大于等于3.5。即測得血 Phe濃度≥120 mol/L時Phe/Tyr的比值大于等于3.5，則需召回病例進行復查，若Phe仍大于120 mol/L，且Phe/Tyr的比值大于3.5。則可認為是可疑 PKU 陽性病例。

1.6 統計學方法

2 結 果

2.1 線性范圍

MS/MS法檢測Phe的線性范圍為 25.3～898.5 mol/L，Tyr的線性范圍為39.60～260.07 mol/L，經統計學分析新生兒患者在男、女之間Phe和Tyr的濃度均無顯著性差異(P=0.345)

2.2 平均回收率和變異系數

MS/MS法檢測新生兒血中Phe濃度的平均回收率為97.8%, Tyr濃度的平均回收率為96.5%，具體指標見下表(表1)。

表1 MS/MS法檢測新生兒血中Phe和Tyr的回收率及變異系數 (%)

2.3 健康新生兒和臨床疑似PKU新生兒全血Phe和Phe/Tyr比值的比較

MS/MS法檢測健康新生兒全血Phe的濃度為(43.5±2.1) mol/L，經MS/MS法檢測，最終確定PKU陽性2例，其PHe，Tyr及兩者比值見下表(表2)。同時計算得健康新生兒全血Phe/Tyr<3.5, 陽性PKU組Phe/Tyr>3.5。

表2 MS/MS法顯示PKU新生兒患者Phe，Tyr及兩者比值

注：標本號 “1、2”代表PKU陽性的2例患者

3 討 論

PKU是一種常染色體隱性遺傳代謝性疾病，是由于體內PAH活性降低導致苯丙氨酸向酪氨酸代謝受阻，導致血液中甚至尿中的苯丙氨酸濃度升高，而高濃度的苯丙氨酸會影響腦部發育，導致患兒智力低下和生長發育緩慢。PKU又稱為苯丙氨酸羥化酶缺乏癥(phenylalanine hydroxylase deficiency)，是氨基酸代謝性疾病中最常見的類型，苯丙氨酸滿足人體生長和代謝的需要，但高濃度的苯丙氨酸，及低濃度的酪氨酸都將嚴重影響患兒的正常生長和發育。全球發病率約為1/1.5萬，隨民族和地區而不同，而我國的發病率已經達到了0.1%。其臨床癥狀一般為：患兒在剛出生時一般會表現為正常，但是也存在一些患兒會出現喂養困難、嘔吐、脾氣暴躁易發怒等非特異性癥狀，但伴隨著進奶后血中苯丙氨酸及其代謝產物的升高，到3～5個月開始會表現出生長緩慢，皮膚蒼白的癥狀，并且由于合成的黑色素減少，患兒的頭發會由黑色逐漸轉變為黃色，并且經患兒排出的汗液及尿液中有特殊的鼠臭味，伴有濕疹[5]。但是該病若在早期發現并給予積極治療的話，兒智力發育可以完全正常，是少數幾種可以通過早期診斷、治療預防其智能障礙出現的疾病之一[6]。

研究證明，全血中苯丙氨酸的濃度對于PKU 的早期篩查，診斷和治療等具有極其重要的意義[7,8]。PKU的篩查和檢驗的方法有多種，目前主要包括細菌抑制法，熒光法，比色法，高效液相色譜法，MS/MS法，高效毛細管電泳法等[9,10]。相對于其他方法，MS/MS的最大優勢就是能夠將診斷的假陰性和假陽性率大大降低, 它的實現主要取決于MS/MS在特異性和靈敏度方面的顯著優勢, 而只有對其進行方法學考核才能夠確保這些優勢能實際應用于臨床實踐。實施考核時, 應該重點考察方法的特異性、重復性和準確度。其次應該進行方法驗證。取一定已知結果的陽性和陰性樣本, 打亂后應用MS/MS法進行分析, 然后將譜篩查結果同已知結果進行對比，來對方法進行驗證。

由于MS/MS可最大程度的減少假陽性率，故目前多采用這種方法對新生兒苯丙酮尿癥進行篩選。本研究中，我們采用MS/MS對血中Phe濃度進行了測定，此法顯示出高效、快速、靈敏度高，特異性好，檢測時間短，不需衍生化處理。線性范圍寬，精密度高，重復性好，用血量少，在臨床上，尤其對新生兒苯丙酮尿的篩選意義重大，有助于其早期診斷，可提高其治愈率。但由于樣本量有限，該實驗結果有待進一步驗證。盡管MS/MS有很多優勢，但并不能完全取代傳統的篩查方法。隨著其日益成熟，MS/MS將有可能為更多的疾病進行分析篩查。