NF-κB寡核苷酸誘騙策略構建膠原誘導性關節炎大鼠耐受性DC①

田婭玲 寧麗常 岳 萍 蔣紅梅

(貴州醫科大學，貴陽550004)

類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種致殘率較高的自身免疫性疾病。抗原遞呈細胞(Antigen presenting cell,APC)對自身抗原的異常遞呈，使自身反應性T細胞活化，主要由Th1細胞介導，這是導致RA發生的主要原因之一[1，2]。 DC是在T細胞活化過程中起關鍵作用的APC，是目前唯一已知能激活初始型T(naive T)細胞的APC。在自身免疫過程中，DC的生物學功能具有雙重性：成熟DC可以激活T細胞，具有免疫激活功能；而未成熟DC(immature dendritic cells,iDCs )可以使T細胞對自身抗原耐受，具有免疫抑制能力。由于未成熟DC表面低表達或不表達CD80、CD86等共刺激分子，使抗原特異性T細胞失活、無反應和調節性T細胞(Treg)形成，因而被認為是“耐受性DC”。近年來DC在器官移植領域引起了廣泛的關注，其誘導免疫耐受的特性成為研究熱點[3，4]。目前國內外已有方法抑制DC成熟，增強其免疫耐受的作用。例如用一些免疫抑制劑或通過轉基因技術在DC內導入免疫抑制分子等方法，但這些方法均有不同程度的弊端[5，6]。NF-κB ODN Decoy策略是一項新的反義技術。利用與 NF-κB靶基因的κB位點(cis元件)相一致的ODN序列，競爭性地占據NF-κB上靶基因啟動區結合部位，從而使轉錄因子無法有效調節靶基因的表達[5]。應用 NF-κB特異性的ODN Decoy可有效阻斷DC細胞內NF-κB活性，使DC呈現出不成熟的表型和功能，且這種抑制作用具有很高的穩定性[6]。因此，與其他抑制DC成熟的方法相對比，ODN抑制DC成熟具有一定的優勢。CIA模型是模擬人類RA最經典的動物模型之一，本實驗將從病程中CIA大鼠脾臟提取單核細胞并在體外誘導成DC，利用 Decoy策略，將NF-κB ODN Decoy導入細胞，阻斷細胞內NF-κB活化從而抑制DC成熟，并綜合評價其形態特征、表面表達共刺激分子情況和刺激混合淋巴細胞反應的能力等。本研究擬探討將CIA大鼠脾臟來源的DC構建成穩定的耐受性DC，為此耐受性DC應用于CIA模型大鼠體內干預試驗提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 雌性SD大鼠，約250 g，7～8月齡，雄性Wistar大鼠(約320 g)，SPF級，來自于貴州醫科大學實驗動物中心。

1.1.2主要試劑及儀器 PE conjugated anti-rat CD80(B7-1)批號12-0800、FITC conjugated anti-rat CD86(B7-2)批號11-0860、PE conjugated anti-rat CD103(αE2,DC marker)又稱抗大鼠OX-62，批號 12-1030(eBioscience)；牛Ⅱ型膠原(BⅡC)批號 038K3798(Sigma)；Recombinant Rat GM-CSF 批號96-400-23、Recombinant Rat IL-4 批號 400-04-069111(Peprotech)；NF-κB誘騙劑(NF-κB ODN Decoy)參考Xu等[7]以及Bonham等[8]的方法并根據實驗需要進行改進。正義序列是：AGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCC，下劃線標記的為與NF-κB特異性結合位點，用硫代磷酸酯修飾堿基全部(上海生工)； 流式細胞儀：BD FACSAriaTM等。

1.2方法

1.2.1CIA大鼠脾臟單核細胞誘導成DC 方法見文獻[9]：取大鼠脾臟于含5%雙抗的1640培養基中4℃保存備用；2 mg/ml Ⅳ型膠原酶消化組織；置200目濾網研磨，收集懸液，1 500 r/min離心10 min；分離單個核細胞2 000 r/min離心20 min；PBS重懸600 r/min離心10 min，洗2 次；臺盼藍計數細胞總數和活力。調整細胞密度(3～5)×106個/ml，2 ml/孔于6孔板，37℃孵育90 min， PBS液洗滌2～3 次。加全培2 ml/孔，細胞因子GM-CSF 30 ng/ml和IL-4 20 ng/ml。隔天半量換液并補充全培及細胞因子，第8 天收獲細胞。

1.2.2實驗分組及處理 ①單純DC組(Control-DC):加細胞因子直接誘導培養；②Decoy誘導DC組(Decoy-DC):在培養初，加細胞因子的同時，加入終濃度為10 μmol/L的NF-κB ODN Decoy培養；③LPS刺激DC組(LPS-DC):加細胞因子培養后第7 天加LPS，終濃度為10 μg/L；④LPS刺激Decoy-DC組(LPS-Decoy-DC):加NF-κB ODN Decoy 培養后第7 天，加LPS繼續培養24 h，終濃度為10 μg/L。

1.2.3構建大鼠CIA模型 10 mg BⅡC溶解于5 ml 0.1 mol/L乙酸溶液中，4℃過夜。次日將膠原和弗氏完全佐劑按1∶1比例混勻，制成BⅡC乳劑，濃度為1 mg/ml，4℃保存。于大鼠的左足跖部皮內注射200 μl BⅡC乳劑，第14 天后于大鼠尾根部皮下以相同劑量BⅡC乳劑進行加強免疫。用相同劑量的生理鹽水注射正常對照組。

1.2.4形態學觀察 每天用光學倒置相差顯微鏡觀察DC的形態學變化。

1.2.5流式細胞術檢測DC表面標志 收集各組培養至第8 天的DC，細胞數調到約1×106個/ml。PBS洗滌，100 μl PBS重懸。各組加流式抗體后避光孵育40 min：PE-OX-62抗體1.25 μl/106細胞，PE-CD80抗體2.5 μl/106細胞，FITC-CD86抗體1 μl/106細胞。PBS洗2次，100 μl PBS重懸，分別培養三批次細胞進行流式檢測。

1.2.6DC體外混合淋巴細胞反應 反應細胞：無菌取雄性Wistar大鼠脾臟，200目細胞篩研磨并收集懸液，1 500 r/min離心5 min，PBS洗2 次；裂解紅細胞；5 ml PBS 1 500 r/min離心5 min，洗滌3 次，全培重懸，細胞調整為1×106個/ml。刺激細胞：將各組DC誘導培養第8 天后，加終濃度為25 μg/ml的絲裂霉素C，37℃孵育30 min。1 000 r/min離心10 min，PBS洗3 次。調整為2×105個/ml。5組DC均以上述方法處理?；旌狭馨图毎磻喊幢?中順序加刺激細胞和反應細胞于56孔板中。共5組，每組分別設8 個復孔。37℃培養68 h。參考文獻[10]確定刺激細胞和反應細胞的混合比例，最敏感比例1∶5。培養68 h后，600 r/min離心10 min，每孔取培養上清50 μl于EP管，-20℃保存。加MTT 20 μl/孔，37℃孵育4 h。2 000 r/min離心10 min，棄上清，加DMSO 100 μl/孔。酶標儀490 nm 處測定OD值。

1.2.7混合淋巴細胞反應培養基上清液細胞因子檢測 將所收集標本從-20℃取出解凍并平衡至室溫，采用雙抗體夾心法酶聯免疫吸附技術(ELISA)原理檢測混合淋巴細胞反應培養基上清液中IFN-γ和IL-10的含量，具體方法參照試劑商提供的說明書進行。

2 結果

2.1體外培養DC的形態特征 第0 天，呈單核細胞形態，各組細胞經臺盼藍染色，未染色細胞均>90%；第2 天，部分細胞懸浮，少量集落；第4～5天，形態明顯不同；第6～8天，少量懸浮細胞及集落邊緣見毛發樣突起。貼壁細胞較多集落，細胞見細長偽足。單純DC組加LPS后，細胞從集落中散開，細胞周邊毛發樣突起明顯多于其他組。而Decoy-DC組和LPS的Decoy-DC組形態類似，周邊毛發樣突起較少。見圖1。

2.2細胞表面OX-62標志檢測 本實驗從大鼠脾臟中提取并誘導培養成DC的OX-62表達率為56.7%。見圖2。

2.3DC細胞表面CD80和CD86分子的表達情況 Decoy-DC組CD80和CD86陽性率和平均熒光強度顯著低于Control-DC組(P<0.05)；LPS刺激Decoy-DC組CD80和CD86陽性率和平均熒光強度顯著低于LPS-DC組(P<0.05)；LPS-Decoy-DC組CD80和CD86陽性率和平均熒光強度與Decoy-DC比無顯著性差異(P>0.05)。見表2、圖3～5。

表1 各實驗組混合淋巴細胞反應處理方法

Tab.1 Treatment of mixed lymphocyte reaction in various experimental groups

GroupsReaction systemBlank control groupReaction cell 100 μl+complete 1640 medium 100 μlControl-DC groupControl-DC group stimulate cell 100 μl+reaction cell 100 μlLPS-DC groupLPS-DC group stimulate cell 100 μl+reaction cell 100 μlDecoy-DC groupDecoy-DC group stimulate cell 100 μl+reaction cell 100 μlLPS-Decoy-DC groupLPS-Decoy-DC group stimulate cell 100 μl+reaction cell 100 μl

圖1 DC培養不同階段的形態學觀察Fig.1 Morphological observation of different stages of DC cultureNote:A.Day 0(×200);B.Day 2(×100);C.Day 4(×100);D.Day 5(×200);E.CIA control-DC(×200);F.CIA decoy-DC(×200);G.CIA-LPS-DC(×200);H.CIA LPS-Decoy-DC(×200).

GroupsCD80Positive rate Mean fluorescence intensityCD86Positive rate Mean fluorescence intensityControl-DC group60.87±4.35758.00±137.5840.57±7.15932.67±309.60Decoy-DC group 24.04±8.111)352.33±83.101)16.63±3.181) 375.33±15.501)LPS-DC group63.70±7.741 145.00±198.64 54.58±11.331 202.33±218.98Decoy-LPS-DC group36.83±8.502)622.00±105.262)19.66±4.862) 497.00±182.042)

Note：1)P<0.01 vs Control-DC group；2)P<0.05 vs LPS-DC group.

2.4不同組DC細胞對同種異體淋巴細胞刺激的反應 Decoy-DC組刺激淋巴細胞的能力顯著低于Control-DC組(P<0.05)。LPS-Decoy-DC組刺激淋巴細胞增殖的能力明顯低于LPS-DC組(P<0.05)。LPS-Decoy-DC組刺激淋巴細胞增殖能力與Decoy-DC組比，無顯著性差異(P>0.05)。見表3。

2.5同種異體淋巴細胞反應中培養液上清IFN-γ和IL-10的測定結果 Decoy-DC組IFN-γ分泌能力顯著低于Control-DC組(P<0.05)，而IL-10分泌能力顯著高于Control-DC組(P<0.05)。LPS刺激Decoy-DC組IFN-γ分泌能力顯著低于LPS-DC組(P<0.05)，而IL-10分泌能力顯著高于LPS-DC組(P<0.05)。見表4。

圖2 DC表面OX-62標志的流式細胞術檢測散點圖Fig.2 Detection data of OX-62 on DC stained with PE by FCM

圖3 各組DC細胞表面CD80、CD86表達情況的流式細胞術散點圖Fig.3 Detection data of CD80 and CD86 on DC stained with PE and FITC by FCM

圖4 DC表面CD80表達的流式細胞術檢測直方圖Fig.4 Detection data of CD80 on DC stained with PE by FCM

圖5 DC表面CD86表達的流式細胞術檢測直方圖Fig.5 Detection data of CD86 on DC stained with PE by FCM

GroupsnOD valueControl-DC group80.205±0.056Decoy-DC group80.141±0.0191)LPS-DC group80.214±0.076LPS-Decoy-DC group80.170±0.0342)

Note：1)P<0.05 vs Control-DC group；2)P<0.05 vs LPS-DC group.

GroupsnIL-10(ng/ml)IFN-γ(ng/L)Control-DC group50.949±0.06743.07±13.70Decoy-DC group51.152±0.1501)24.74±0.931)LPS-DC group50.922±0.03262.31±23.44Decoy-LPS-DC group51.112±0.1812)27.77±2.332)

Note：1)P<0.05 vs Control-DC group；2)P<0.05 vs LPS-DC group.

3 討論

類風濕關節炎是一種涉及全身多因素的自身免疫性疾病。近年來研究發現，T淋巴細胞的異常活化、增殖和細胞因子分泌失衡在RA中充當非常重要的角色。DC是一種在體內不同于巨噬細胞、B淋巴細胞的抗原遞呈細胞，能唯一活化靜息型T淋巴細胞，引發初次免疫應答，并能點狀放大刺激，從而刺激T淋巴細胞增殖[11]。DC成熟狀態的不同意味著激活T淋巴細胞的程度和反應類型不同[12]。因此在誘導T淋巴細胞活化或耐受方面，DC的成熟狀態顯得尤為重要。成熟DC經抗原遞呈作用將共刺激分子遞呈給初始T淋巴細胞，活化T淋巴細胞，激活免疫反應；未成熟DC表面低表達或缺乏B7等共刺激分子，不能有效激活T淋巴細胞，使T淋巴細胞失活或無反應，從而誘導T淋巴細胞的免疫耐受。本實驗利用NF-κB ODN Decoy策略抑制CIA大鼠脾臟來源的DC成熟，最終使其成為“耐受性DC”。

通過參考文獻[9]并結合本實驗室情況進行改良，取CIA大鼠脾臟，經研磨及膠原酶消化法獲得脾臟細胞懸液，密度梯度離心法分離單個核細胞，利用單核細胞短暫貼壁的特性去除不貼壁淋巴細胞獲得單核細胞，加細胞因子GM-CSF和IL-4誘導培養成DC。檢測DC表面OX62的表達率，目前雖然有一些其他細胞也表達OX-62，但因為其含量極少，故OX-62目前仍被認為是大鼠DC最特異的標志[13]；并結合其特異的形態學特征和表面共刺激分子CD80、CD86等，從而鑒定所誘導培養的細胞為DC。未成熟DC具有能將ODN攝取到DC細胞內的功能，在單核細胞開始培養時和細胞因子一起加入ODN，使細胞因子誘導的DC在生長過程中便可以自動攝取ODN[7,8,14]。鏡下觀察，單純培養DC組細胞形態不規則，周邊毛發樣突起較多，流式檢測DC表面共刺激分子CD80、CD86呈高表達，呈現出相對成熟的特征。在Decoy-DC組實驗中將NF-κB ODN Decoy導入DC中，細胞周邊毛發樣突起較少，流式檢測與Control-DC組相比，DC細胞表面共刺激分子 CD80、CD86低表達，呈現出一種相對未成熟DC特征。用LPS分別對Control-DC組DC和Decoy-DC組DC進行刺激，結果顯示Control-DC組DC經LPS刺激后細胞毛刺樣突起增多，生長旺盛，較多DC從集落周邊脫落，流式檢測其共刺激分子CD80和CD86表達量增高；與Control-DC加LPS相比，Decoy-DC組加LPS后，其細胞毛刺樣突起增加不明顯，并且CD80和CD86表達量無明顯增加。此結果與前期Jiang等[15]通過NF-κB ODN Decoy處理正常大鼠脾臟來源DC的研究結果類似。以上結果表明，ODN策略能夠使其構建的耐受性DC表型穩定，不易經外界條件刺激變得成熟。進一步用培養至第8天的各組DC分別與Wistar大鼠脾臟來源的淋巴細胞混合培養，結果顯示Decoy-DC組刺激混合淋巴細胞增殖能力低于Control-DC組，加LPS后其刺激能力并無明顯增加。通過檢測混合淋巴細胞反應中各組細胞培養基上清中細胞因子發現，Decoy-DC組混合淋巴反應中高分泌IL-10，低分泌IFN-γ，LPS刺激后結果無明顯差異，而Control-DC組與之正好相反，進一步說明NF-κB ODN Decoy誘導的耐受性DC其耐受功能具有較好的穩定性。

本實驗將病程中CIA大鼠脾臟細胞誘導成DC，用NF-κB特異性的ODN Decoy誘導其耐受性，發現誘導的DC表面共刺激分子同樣表達低下，用LPS作用后并未明顯升高。這說明雖然正常大鼠用膠原誘導成CIA模型，具有典型的類風濕關節炎癥狀如關節中滑膜組織炎性細胞浸潤，成纖維細胞過度增生，新生血管翳形成，骨和軟骨被破壞等，但并沒有影響到脾臟細胞誘導成耐受性DC。

綜上所述，用病程中CIA大鼠脾臟細胞經NF-κB特異性的ODN decoy誘導成功培養出耐受性DC，說明病程中CIA大鼠來源的DC和正常大鼠來源的DC特性類似，均可用NF-κB ODN Decoy策略構建穩定的耐受DC。并有望在后續CIA模型大鼠的體內實驗中進一步研究該DC的治療效果和相關機制。