GANT61阻斷Hedgehog信號(hào)通道調(diào)控肺腺癌A549/DDP細(xì)胞耐藥的機(jī)制研究①

鄭 濤 李 華 張 黎 張獻(xiàn)全

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤科，重慶400010)

肺癌是死亡率最高的惡性腫瘤[1]。非小細(xì)胞肺癌占肺癌總數(shù)的85%，由于早期癥狀不典型，大部分患者確診時(shí)已是ⅢB期或IV期。近年來(lái)分子靶向治療明顯地提高了非小細(xì)胞肺癌患者的生存時(shí)間，但仍有超過(guò)40%患者因未找到合適的靶點(diǎn)，故以鉑類為基礎(chǔ)的化療依然是標(biāo)準(zhǔn)一線治療方案[2]。由于腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑存在原發(fā)性或后天獲得性耐藥，縮短了患者的總生存期[3]。腫瘤細(xì)胞耐藥性受多條信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)控，其中包括Hedgehog(Hh)信號(hào)通路[4]。該通路在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤中激活[5]。經(jīng)典的Hedgehog信號(hào)通路傳導(dǎo)途徑可簡(jiǎn)單歸納為：Hh-Ptch-Smo-Gli(Gli1、Gli2、Gli3)，其中Gli1的表達(dá)量通常被認(rèn)為是Hh信號(hào)傳導(dǎo)活性的量度[6]。GANT61是轉(zhuǎn)錄因子Gli1有效的抑制劑[7]。已有研究證明GANT61有明確的抗腫瘤作用，如胃癌[8]、口腔癌[9]。Gli1的過(guò)表達(dá)與腫瘤化療耐藥密切相關(guān)，GANT61能特異性阻滯Gli1從而改善惡性腫瘤細(xì)胞的化療敏感性[10-12]。近年來(lái)研究表明Hedgehog信號(hào)通路的激活與進(jìn)展期非小細(xì)胞肺癌中鉑類化療耐藥可能相關(guān)[13],因此通過(guò)抑制該信號(hào)通路為逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌對(duì)順鉑耐藥帶來(lái)了可能。

目前有關(guān)GANT61對(duì)耐藥肺癌細(xì)胞的影響及機(jī)制研究甚少。本研究以人肺腺癌細(xì)胞A549/DDP為研究對(duì)象，觀察GANT61對(duì)A549/DDP的抑制效應(yīng)、GANT61與順鉑的聯(lián)合使用的協(xié)同效應(yīng)，并通過(guò)檢測(cè)與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白來(lái)探討其分子機(jī)制，為肺腺癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞系 人肺腺癌A549細(xì)胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院惠贈(zèng)。人肺腺癌A549/DDP細(xì)胞株購(gòu)自國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)。

1.1.2藥品與試劑 RPMI1640培養(yǎng)基、雙抗(青-鏈霉素)購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自以色列BI公司，兔抗人Gli1單克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling公司，兔抗人Shh、Ptch1、XRCC1、cyclinD1、cleaved caspase-3、c-myc單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，兔抗人β-actin多克隆抗體購(gòu)自Proteintech公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(二抗)購(gòu)自江蘇碧云天公司，GANT61、順鉑購(gòu)自Sigma公司，CCK8細(xì)胞毒性試劑盒購(gòu)自DOJINDO公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 兩種細(xì)胞株均在37℃、5%CO2條件下孵育，采用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及0.1 mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。A549/DDP細(xì)胞在每次傳代貼壁后用2 μg/ml的順鉑維持耐藥性。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)消化傳代，常規(guī)傳代的時(shí)間為每2～3 d。實(shí)驗(yàn)前1周停止順鉑刺激A549/DDP細(xì)胞。選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的A549及A549/DDP細(xì)胞株制成細(xì)胞懸液，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml，96孔板每孔接種量為100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)24 h待細(xì)胞完全貼壁后分別加入1、2、4、8、16、32 μg/ml的順鉑溶液處理A549、A549/DDP細(xì)胞48 h，檢測(cè)順鉑不同濃度下A549、A549/DDP細(xì)胞的抑制率，使用GraphPad Prism 5計(jì)算兩株細(xì)胞IC50，得到A549/DDP耐藥指數(shù)(RI)=A549/DDP細(xì)胞IC50/A549細(xì)胞IC50。按照上述方法，以2.5、5、10、20、40、80 μmol/L的GANT61處理A549/DDP細(xì)胞，種板密度為5×105個(gè)/ml、3.5×105個(gè)/ml時(shí)分別處理24 h、72 h，測(cè)定不同濃度GANT61對(duì)A549/DDP細(xì)胞的抑制率。同理，取A549/DDP細(xì)胞以3.5×105個(gè)/ml接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后以20 μmol/L的GANT61預(yù)處理細(xì)胞24 h，然后給予20 μmol/L的GANT61和4種濃度梯度(1、2、4、8 μg/ml)的順鉑溶液聯(lián)合處理細(xì)胞48 h后檢測(cè)聯(lián)合用藥抑制率。以上試驗(yàn)均設(shè)置不含藥物(但GANT61組需加0.1%DMSO)、含細(xì)胞的對(duì)照組和只含培養(yǎng)基的調(diào)零組，每組均給予5個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)終止前，棄去含藥培養(yǎng)基，加入含10% CCK8溶液的無(wú)血清培養(yǎng)基100 μl，30 min后置于酶標(biāo)自動(dòng)分析儀，在450 nm波長(zhǎng)測(cè)定光吸收值[A]。按以下公式計(jì)算各組存活率：存活率=[(實(shí)驗(yàn)組A-調(diào)零孔A)/(對(duì)照組A-調(diào)零孔A)]×100%。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549/DDP細(xì)胞傳代貼壁后，分別加入含30、60 μmol/L 的GANT61完全培養(yǎng)基，陰性對(duì)照組培養(yǎng)基中加入0.1% DMSO。培養(yǎng)24 h后PBS洗滌2次、胰酶消化、收集細(xì)胞，加入75%乙醇1 ml吹打成細(xì)胞懸液，300目濾網(wǎng)過(guò)濾，4℃固定24 h后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549/DDP細(xì)胞傳代貼壁后，分別加入含30、60 μmol/L的GANT61完全培養(yǎng)基處理24 h，陰性對(duì)照組培養(yǎng)基中加入0.1%DMSO。PBS洗滌2次、胰酶消化、離心細(xì)胞，加入1 ml的PBS吹打成細(xì)胞懸液，300目濾網(wǎng)過(guò)濾，用Annexin V/PI雙染色法在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5Western blot檢測(cè) 將細(xì)胞分為3大組：第1大組為正常培養(yǎng)的A549、A549/DDP細(xì)胞；第2大組為分別給予30、60 μmol/L的GANT61處理24 h的A549/DDP細(xì)胞，0.1%DMSO處理作為陰性對(duì)照；第3大組包括順鉑單藥組(4 μg/ml處理48 h)、GANT61單藥組(20 μmol/L處理72 h)、GANT61聯(lián)合順鉑組(20 μmol/L GANT61預(yù)處理24 h，再給予20 μmol/L GANT61和4 μg/ml順鉑聯(lián)合處理48 h)、陰性對(duì)照組(0.1%DMSO處理72 h)。將上述處理的細(xì)胞加入適量裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1) 提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，TBST洗膜3次后加入一抗，分別以稀釋過(guò)的Gli1抗體(1∶1 000)、Ptch1抗體(1∶1 000)、Shh抗體(1∶2 000)、cyclinD1抗體(1∶5 000)、c-myc抗體(1∶10 000)、cleaved caspase-3抗體(1∶500)、XRCC1抗體(1∶2 000)及β-actin抗體(1∶2 000) 4℃孵育過(guò)夜，次日將膜用TBST漂洗3次，再以HRP(辣根過(guò)氧化物酶)標(biāo)記的二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h，TBST再次漂洗3次，最后用ECL法顯影，image-lab軟件行灰度分析。

1.2.6協(xié)同作用的評(píng)估 根據(jù)下列公式評(píng)價(jià)體外聯(lián)合用藥作用：Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb) Ea+b表示聯(lián)合用藥抑制率，Ea、Eb分別表示a、b單藥的抑制率。明顯拮抗(--)時(shí)Q值<0.55，拮抗(-)時(shí)Q值為0.55～0.85，單純相加(+)時(shí)Q值為0.86～1.15，增強(qiáng)(++)時(shí)Q值為1.16～2.00。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)評(píng)價(jià)多組間兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1A549/DDP細(xì)胞的耐藥指數(shù)(RI) CCK8結(jié)果表明：相同順鉑濃度下A549/DDP細(xì)胞的存活率明顯高于A549細(xì)胞(圖1A)。A549細(xì)胞IC50為(1.55±0.35)μg/ml，A549/DDP細(xì)胞IC50為(8.28±1.00)μg/ml，其耐藥指數(shù)約為5.34(t=11.03，P<0.01)(圖1B)，證實(shí)A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2Hedgehog信號(hào)通路在A549/DDP細(xì)胞中激活 Western blot從蛋白水平檢測(cè)兩種細(xì)胞中Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)蛋白Ptch1、Gli1、Shh的表達(dá)(圖2A)。相比于A549細(xì)胞，A549/DDP細(xì)胞中Ptch1、Gli1、Shh在蛋白水平的表達(dá)均明顯增高(t=4.09，P<0.05；t=5.93，P<0.01；t=8.98，P<0.01)(圖2B)。

2.3XRCC1蛋白在A549、A549/DDP細(xì)胞中的表達(dá)差異 Western blot從蛋白水平檢測(cè)兩種細(xì)胞中XRCC1的表達(dá)(圖3A)。相比于A549細(xì)胞，A549/DDP細(xì)胞中XRCC1在蛋白水平的表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.30，P<0.01)(圖3B)。結(jié)果說(shuō)明XRCC1高表達(dá)可能與A549/DDP細(xì)胞耐藥相關(guān)。

2.4GANT61對(duì)A549/DDP細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 圖4A表明：A549/DDP細(xì)胞經(jīng)不同濃度GANT61作用24 h后，濃度≥20 μmol/L時(shí)A549/DDP細(xì)胞活力降低，且隨著濃度增大，細(xì)胞抑制作用明顯，呈濃度依賴性(F=145.62，P<0.01)。GANT61處理A549/DDP細(xì)胞24 h的IC50為(49.03±5.75) μmol/L。因此在后續(xù)試驗(yàn)中我們選用IC50左右的濃度(30、60 μmol/L)處理細(xì)胞，用于檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響。圖4B表明：A549/DDP細(xì)胞經(jīng)不同濃度GANT61作用72 h后，濃度為2.5 μmol/L時(shí)A549/DDP細(xì)胞活力增加(t=3.59，P<0.01)；5 μmol/L時(shí)細(xì)胞活力無(wú)明顯變化(P>0.05)；≥10 μmol/L時(shí)A549/DDP細(xì)胞活力降低，且隨著濃度增大，細(xì)胞抑制作用越明顯，呈濃度依賴性(F=376.66，P<0.01)。GANT61處理A549/DDP細(xì)胞72 h的IC50為(22.74±2.03) μmol/L。20 μmol/L GANT61對(duì)A549/DDP細(xì)胞的抑制率為(40.3±6.11)%，因此，我們選用20 μmol/L GANT61聯(lián)合順鉑培養(yǎng)細(xì)胞72 h 為條件，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 順鉑對(duì)A549及A549/DDP細(xì)胞的存活率和IC50的影響Fig.1 Effect of Cisplatin on survival rate and DDP IC50 for A549 cells and A549/DDP cellsNote：**.P<0.01，vs the control (A549 cells)；n=3.

2.5GANT61對(duì)A549/DDP細(xì)胞凋亡率的影響 隨著GANT61濃度的增加，A549/DDP細(xì)胞凋亡逐漸增加(F=19.36，P<0.01)(圖5A)。30、60 μmol/L GANT61作用于A549/DDP細(xì)胞24 h后，凋亡率分別為(10.26±2.53)%和(16.29±2.83)%，與對(duì)照組凋亡率(4.89±0.84)%相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.93，P<0.05；t=6.22，P<30和60 μmol/L GANT61處理組的G1期細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組(t=5.72，P<0.01；t=9.51，P<0.01)，而S期細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組(t=2.46，P<0.05；t=5.37，P<0.01)(圖6B)。結(jié)果說(shuō)明，GANT61作用可使A549/DDP細(xì)胞阻滯在G1期。

圖2 Western blot檢測(cè)Ptch1、Gli1、Shh蛋白在A549、A549/DDP細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 Expression level of Ptch1，Gli1 and Shh protein in A549 and A549/DDP cells were detected by Western blotNote：*.P<0.05，**.P<0.01，vs the control (A549 cells)；n=3.

圖3 Western blot 檢測(cè)XRCC1蛋白在A549、A549/DDP細(xì)胞中的表達(dá)Fig.3 Expression level of XRCC1 protein in A549 and A549/DDP cells were detected by Western blotNote：*.P<0.01，vs the control (A549 cells)；n=3.

0.01)(圖5B)。

2.6GANT61對(duì)A549/DDP細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期表明(圖6A)：隨著GANT61濃度的增加，G1期細(xì)胞逐漸增加(F=45.80，P<0.01)，S期細(xì)胞逐漸減少(F=14.45，P<0.01)。各時(shí)期的細(xì)胞比例如下：空白對(duì)照組:G1期(64.17±5.38)%、S期(23.67±6.75)%、G2期(8.67±2.13)%；30 μmol/L GANT61組:G1期(81.74±3.37)%、S期(14.14±4.26)%、G2期(4.11±1.90)%；60 μmol/L GANT61組:G1期(93.4±1.50)%、S期(2.87±1.96)%、G2期(3.97±1.22)%。

圖4 CCK8檢測(cè)不同濃度的GANT61處理對(duì)A549/DDP細(xì)胞活力的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of different concentrations of GANT61 on viability of A549/DDP cells was detected by CCK8Note：A.24 h；B.72 h.**.P<0.01，vs 0 μmol/L GANT61(as the control )；n=3.

圖5 不同濃度的GANT61處理24 h對(duì)A549/DDP細(xì)胞凋亡率的影響Fig.5 Effect of different concentrations of GANT61 treatment for 24 h on the apoptotic rate of A549/DDP cells was detected with Annexin V-FITC/propidium iodide staining and flow cytometryNote：*.P<0.05，**.P<0.01，vs the control (0 μmol/L GANT61)；n=3.

2.7GANT61對(duì)A549/DDP細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 A549/DDP細(xì)胞經(jīng)不同濃度GANT61作用24 h后，結(jié)果(圖7A～C)顯示：各組細(xì)胞中Gli1、c-myc、cyclinD1、cleaved caspase-3隨著GANT61濃度的增高表達(dá)水平有顯著差異(F值分別為51.29、24.45、44.89、26.70，P值均<0.01)；其中，30、60 μmol/L GANT61處理組的Gli1、c-myc、cyclinD1表達(dá)量均較對(duì)照組明顯降低(t值分別為6.51、9.97、3.91、6.98、5.91、9.37，P值均<0.01)，cleaved caspase-3表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高(t=2.46，P<0.01；t=7.19，P<0.01)。

2.8GANT61聯(lián)合順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞體外增殖的影響 培養(yǎng)至72 h時(shí)，20 μmol/L GANT61與小于IC50濃度的順鉑(1、2、4、8 μg/ml)聯(lián)合用藥對(duì)A549/DDP細(xì)胞的增殖抑制率均呈增強(qiáng)作用(見(jiàn)表1、2)。

2.9GANT61與順鉑聯(lián)合用藥對(duì)A549/DDP細(xì)胞中XRCC1蛋白表達(dá)的影響 20 μmol/L GANT61、20 μmol/L GANT61與4 μg/ml順鉑聯(lián)合用藥均能使XRCC1表達(dá)量顯著下降(圖8A)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.10，P<0.01；t=10.20，P<0.01)(圖8B)。

圖6 不同濃度的GANT61處理24 h對(duì)A549/DDP細(xì)胞周期的阻滯作用Fig.6 Blocking effect of different concentrations of GANT61 for 24 h on cell cycle of A549 /DDP cells was detected by flow cytometryNote：*.P<0.05，**.P<0.01，vs the control (0 μmol/L GANT61)；n=3.

圖7 Western blot檢測(cè)30 μmol/L、60 μmol/L的GANT61對(duì)A549/DDP細(xì)胞Gli1、c-myc、cyclinD1、cleaved caspase-3表達(dá)影響Fig.7 Expression levels of Gli1,c-myc,cyclinD1,cleaved caspase-3 proteins in A549/DDP cells treated with 30 μmol/L and 60 μmol/L GANT61 for 24 h were detected by Western blotNote：1.DMSO control；2.30 μmol/L GANT61；3.60 μmol/L GANT61.*.P<0.05，**.P<0.01，vs the control (0 μmol/L GANT61)；n=3.

Tab.1 Proliferation inhibition rate of A549/DDP cells between cisplatin groups,GANT61 group and combination groups

GroupsConcentration Inhibition rate(%)Cisplatin group1 μg/ml1.97±4.842 μg/ml9.73±2.294 μg/ml25.7±4.558 μg/ml45.3±5.86GANT61 group20 μmol/L39.9±6.81Cisplatin + GANT61 group1 μg/ml+20 μmol/L54.23±9.142 μg/ml+20 μmol/L65.33±7.174 μg/ml+20 μmol/L69.27±7.558 μg/ml+20 μmol/L78.83±7.72

表2 順鉑聯(lián)合GANT61對(duì)A549/DDP細(xì)胞協(xié)同抗腫瘤作用

Tab.2 Synergistic anti-tumor effect of simultaneous administration of cisplatin and GANT61 on A549/DDP cells

Cisplatin + GANT61Q1 μg/ml+20 μmol/L1.322 μg/ml+20 μmol/L1.434 μg/ml+20 μmol/L1.258 μg/ml+20 μmol/L1.17

圖8 Western blot檢測(cè)DDP和GANT61單藥及聯(lián)合用藥后A549/DDP細(xì)胞中XRCC1蛋白的表達(dá)情況Fig.8 Expressions of XRCC1 protein in A549/DDP cells treated with DDP and GANT61 alone and in combination were detected by Western blotNote：**.P<0.01，vs the control (0 μmol/L GANT61)；n=3.

3 討論

本研究顯示，耐順鉑的人肺腺癌A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥指數(shù)為5.34，為中度耐藥細(xì)胞。達(dá)麗雋等[14]研究發(fā)現(xiàn)抑制A549/DDP細(xì)胞中Gli1的表達(dá)能逆轉(zhuǎn)順鉑對(duì)細(xì)胞的耐藥。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)A549/DDP細(xì)胞中Hedgehog信號(hào)通路激活，Western blot結(jié)果顯示其相關(guān)蛋白Ptch1、Gli1、Shh表達(dá)水平均明顯上調(diào)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)A549/DDP細(xì)胞中XRCC1在蛋白水平的表達(dá)較A549細(xì)胞明顯增高，因此我們推測(cè)Hedgehog信號(hào)通路的激活可能通過(guò)上調(diào)XRCC1蛋白的表達(dá)而參與順鉑耐藥。

Hedgehog信號(hào)通路激活后，Hh配體與其受體Ptch結(jié)合后解除對(duì)Smo的抑制，并將該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1、Gli2和Gli3，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、生存、遷移和代謝[15]。非經(jīng)典的Hh信號(hào)通路也調(diào)控Hh/Gli信號(hào)，多種途徑(如AKT、MAPK、RAS、EGFR)可以激活腫瘤細(xì)胞中的Gli因子[16]。GANT61與細(xì)胞核中的Gli1 DNA結(jié)合降低Gli1的轉(zhuǎn)錄活性，抑制Hedgehog通路下游關(guān)鍵組份的活性，無(wú)論Hh信號(hào)激活的模式如何[17]。因此，抑制Hh通路下游的Gli1將會(huì)取得更大效果，故本試驗(yàn)選擇GANT61作為Hh信號(hào)通路的阻滯劑來(lái)研究其對(duì)A549/DDP細(xì)胞的生物學(xué)行為。

本研究通過(guò)CCK8檢測(cè)表明，GANT61處理A549/DDP細(xì)胞24 h，其濃度≥20 μmol/L時(shí)明顯抑制細(xì)胞增殖，且呈現(xiàn)劑量依賴性。GANT61處理A549/DDP細(xì)胞72 h，其濃度≥10 μmol/L也出現(xiàn)相同的效應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示經(jīng)GANT61處理24 h后，A549/DDP細(xì)胞凋亡率隨藥物濃度增加而升高。細(xì)胞周期檢測(cè)表明，隨著GANT61濃度的增高，G1期細(xì)胞比例也逐漸增高，而S期細(xì)胞比例逐漸下降，導(dǎo)致癌細(xì)胞阻滯在G1期。通過(guò)細(xì)胞周期和凋亡的檢測(cè)，說(shuō)明GANT61通過(guò)阻滯細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞凋亡抑制腫瘤細(xì)胞增殖。這些結(jié)果均顯示出GNAT61治療肺癌的廣闊前景。

c-myc是與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)的重要原癌基因，其通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞從G1期到S期的轉(zhuǎn)換促進(jìn)細(xì)胞的增殖[18]。cyclinD1是細(xì)胞周期蛋白家族中調(diào)控G1/S轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵蛋白，該蛋白在腫瘤增殖中起重要作用。Hh/Gli信號(hào)傳導(dǎo)激活導(dǎo)致下游靶基因c-myc、cyclinD1表達(dá)增加，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期[19]。研究表明，GANT61下調(diào)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的Gli1、c-myc和cyclinD1表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡[20]。本研究結(jié)果表明，GANT61處理A549/DDP細(xì)胞后，Gli1蛋白顯著下降，導(dǎo)致其下游靶標(biāo)c-myc、cyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低，從而引起細(xì)胞周期阻滯于G1期。caspase-3是執(zhí)行凋亡過(guò)程的關(guān)鍵蛋白分子，其被活化剪切形成cleaved caspase-3發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡作用。Gli也涉及線粒體凋亡信號(hào)通路，凋亡基因caspase-3被鑒定為Gli的直接轉(zhuǎn)錄靶基因[21]。本研究顯示，GANT61處理A549/DDP細(xì)胞后，cleaved caspase-3表達(dá)增高，說(shuō)明GANT61可能通過(guò)線粒體凋亡途徑導(dǎo)致A549/DDP細(xì)胞凋亡。

順鉑與細(xì)胞內(nèi)DNA發(fā)生交聯(lián)，形成順鉑-DNA加合物，引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)事件，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。堿基切除修復(fù)(BER)、單鏈斷裂修復(fù)(SSBR)、核苷酸切除修復(fù)(NER)途徑參與鉑誘導(dǎo)的DNA損傷；X射線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(XRCC1)蛋白是BER和SSBR途徑的關(guān)鍵組份，其對(duì)于NER也是必需的[22]。Zhang等[23]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)shRNA下調(diào)XRCC1蛋白，抑制了DNA修復(fù)能力，增加順鉑對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的毒性，提高了順鉑的敏感性。Kudo等[24]研究發(fā)現(xiàn)，用抗Gli1 shRNA預(yù)處理耐順鉑的人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780-CP70明顯增加順鉑對(duì)細(xì)胞的殺傷力，將順鉑IC50從30 mmol/L降低至5 mmol/L，與抑制順鉑誘導(dǎo)的XRCC1基因的上調(diào)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)CCK8檢測(cè)表明，順鉑與GANT61聯(lián)合應(yīng)用增強(qiáng)順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞的殺傷作用，具有體外協(xié)同抗增殖作用。GANT61單藥組、GANT61和順鉑聯(lián)合用藥組均能顯著下調(diào)A549/DDP細(xì)胞中XRCC1蛋白的表達(dá)，表明XRCC1可能為Hedgehog信號(hào)通路的下游靶標(biāo)；GANT61與順鉑體外協(xié)同抗增殖作用的機(jī)制與減少A549/DDP細(xì)胞XRCC1蛋白的表達(dá)有關(guān)。

總之，GANT61能夠通過(guò)下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白c-myc和cyclinD1的表達(dá)來(lái)阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，激活caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制人肺腺癌耐藥細(xì)胞A549/DDP的增殖。GANT61與順鉑存在體外協(xié)同抗增殖作用，其機(jī)制可能與減少耐藥細(xì)胞株A549/DDP中XRCC1蛋白的表達(dá)有關(guān)。腫瘤細(xì)胞的增殖和耐藥與多種基因、多種途徑有關(guān)，故仍需進(jìn)一步研究其他機(jī)制。