消銀湯治療銀屑病小鼠模型的實驗研究

史 勇 李冬梅 肖井雷

(長春大學特殊教育學院,長春130022)

銀屑病(Psoriasis，PS)俗稱牛皮癬，中醫稱之為“白疕”，是一種常見的易于復發的慢性炎癥性皮膚病，特征性損害為紅色丘疹或斑塊上覆有多層銀白色鱗屑，銀屑病主要病理改變為表皮增生分化異常、真皮乳頭毛細血管增生擴張和炎癥細胞浸潤[1，2]。增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)和血小板內皮細胞黏附分子(CD31)在細胞增生、分化及血管形成過程中起重要調控作用[3，4]。本研究通過建立銀屑病動物模型，觀察中藥消銀湯治療后銀屑病小鼠血清及皮損區PCNA、VEGF和CD31的表達及分布特點，為探討銀屑病的發病機制及消銀湯的廣泛臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 消銀湯由長春中醫藥大學藥學院提供，其主要成分：黃芪10 g，生地15 g，牡丹皮12 g，赤芍15 g，半枝蓮30 g，白化蛇舌草15 g，槐花10 g，紫草10 g，玄參15 g，丹參15 g，雞血藤15 g，甘草6 g；用水煎煮2次，煎煮合并濃縮液每劑168 ml(1 g/ml)，每天攝入量2.8 g/kg(成人60 kg)。十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)購于北京鼎國生物有限公司；RNA提取試劑Trizol購于Invitrogen公司；RNA反轉錄試劑盒、Taq酶和DL 2000 marker購于塔克拉公司； 兔抗鼠PCNA、VEGF和CD31一抗購于Abcam公司；SP9710和DAB顯色試劑盒購于福州邁新生物有限公司；Biotek Epoch酶標儀；實時熒光定量PCR儀(ABI7300)、Biometra PCR擴增儀(Biotek公司，美國)；OLYMPUS BX51顯微鏡(OLYMPUS公司，日本)。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組及給藥 BALB/c雌性小鼠(合格證號：SCXK遼2015-0001)50只隨機分為對照組、模型組、消銀湯低、中和高劑量組，每組10只。消銀湯組采用灌胃方式給予消銀湯17.3、34.5和69.0 g/kg，對照組及模型組均每日灌胃給予等劑量的生理鹽水，每天2次，連續治療14 d，然后處死取血液和皮膚組織。

1.2.2動物模型制備[5]實驗前1 d全部小鼠背部皮膚去毛(3 cm2)；次日模型組和消銀湯各劑量組小鼠背部去毛處皮膚均勻涂抹10% SDS 2 ml，1次/d，共7 d制備模型；對照組小鼠給予蒸餾水同樣涂抹7 d。

1.2.3樣本采集和檢測指標 各組動物在實驗結束后次日清晨處死，取血液及皮膚組織，一部分于4℃冰箱暫存待測，一部分固定于10%福爾馬林液，每組取10個樣品。

1.2.3.1小鼠皮損組織的病理學觀察 蘇木精-伊紅(HE)染色后，通過OLYMPUS BX51顯微鏡觀察。

1.2.3.2小鼠血液和皮損組織中PCNA、VEGF和CD31 mRNA水平的檢測 采用實時熒光定量PCR法檢測，引物的設計和合成由上海生物工程有限公司提供。PCNA上游引物：5′-GACACATACCGCTGCGATCG-3′，下游引物：5′-TCACCACAGCATCTC-CAATAT-3′，片段307 bp；VEGF上游引物：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′，片段260 bp；CD31上游引物：5′-AGCGTTGAGCCAAGTGTAGAC-3′，下游引物：5′-ATGCTCATGCACGTCCGTGCAT-3′，片段287 bp。每個樣本基因擴增3次，取樣本得Ct值均值，采用2-ΔΔCt表示目的基因相對表達水平。

1.2.3.3小鼠皮損組織中PCNA、VEGF和CD31蛋白的陽性表達強度的檢測 采用免疫組織化學方法，陽性表達呈棕黃色，細胞核復染為藍色。通過Motic Images Advanced 3.2圖像分析軟件分析，蛋白陽性表達強度用光密度值(OD值)表示，OD值越大陽性表達越強。

2 結果

2.1各組小鼠皮損組織的病理改變 HE染色200倍鏡光學顯微鏡下觀察可見，正常組小鼠：表皮較薄排列規則，真皮層未見淋巴細胞浸潤。模型組：與對照組及三個治療劑量組比較，表皮明顯增厚，真皮層淋巴細胞浸潤多見。消銀湯高、中、低劑量組：與對照組比較，表皮均略增厚，真皮層偶見淋巴細胞浸潤，高、中、低劑量組在病理改變方面未見明顯差異，均能使表皮變薄，減輕病變造成的炎癥反應。各組小鼠皮膚的附屬器均未見異常，見圖1。

2.2各組小鼠皮損組織中PCNA、VEGF和CD31蛋白的陽性表達強度 200倍鏡光學顯微鏡下觀察與對照組比較，模型組小鼠皮膚組織中PCNA、VEGF和CD31的蛋白陽性表達強度(OD值)均顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，消銀湯各組小鼠皮膚組織中PCNA、VEGF和CD31蛋白的陽性表達強度(OD值)隨劑量增加顯著降低，且差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.3各組小鼠皮膚組織和血清中PCNA、VEGF和CD31的mRNA水平 與對照組比較，模型組小鼠皮膚組織和血清中PCNA、VEGF和CD31 mRNA水平均顯著升高， 差異有統計學意義(P<0.05)； 與模型組比較，消銀湯各組小鼠皮膚組織和血清中PCNA、VEGF和CD31的mRNA水平隨劑量增加其降低趨勢顯著，且差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

GroupsmRNA level of skin lesions tissuePCNAVEGFCD31mRNA level in serumPCNAVEGFCD31Control group6.33±0.9511.02±1.418.37±1.464.06±0.796.13±0.927.22±1.04Model group16.91±1.281)21.45±2.831)22.52±3.031)8.89±1.311)13.25±2.071)15.01±3.651)Low dose group13.09±1.021)2)17.42±2.511)2)15.19±2.071)2)7.16±1.151)2)10.64±1.811)2)12.36±2.941)2)Medium dose group11.16±1.351)2)3)14.08±1.621)2)3)12.86±2.141)2)3)6.08±1.291)2)3)8.35±1.421)2)3)10.03±1.921)2)3)High dose group8.69±0.971)2)3)4)11.74±1.392)3)4)10.13±1.371)2)3)4)4.67±0.852)3)4)6.71±0.892)3)4)8.52±1.261)2)3)4)

Note：Compared with control group，1)P<0.05;compared with model group，2)P<0.05;compared with Low dose group，3)P<0.05;compared with Medium dose group，4)P<0.05.

圖1 各組小鼠皮膚組織的HE染色、免疫組織化學染色及蛋白陽性表達強度(OD值)的比較

Fig.1 Comparison of HE staining，immunohistochemical staining and protein positive expression in skin tissues of mice in each group

Note: Compared with control group，*.P<0.05;compared with model group，#.P<0.05;compared with Low dose group，△.P<0.05;compared with Medium dose group，▲.P<0.05.

3 討論

銀屑病是一種較常見的易復發的慢性炎癥皮膚病，是具有遺傳傾向的變態反應性皮膚疾病，目前國內外研究發現銀屑病與遺傳、感染鏈球菌、免疫異常、內分泌代謝障礙、環境因素及精神因素等有關，屬于多基因遺傳的疾病[6-8]。銀屑病組織病理學以表皮角化不全、角質形成細胞過度增殖、炎癥細胞浸潤及新生血管形成為主要特征，其確切病因和發病機制尚不清楚[9]。

PCNA是分子量為36 kD的酸性非組胺核蛋白，僅在增殖細胞中合成或表達[10]。1978 年Miyachi 等[11]首次發現并命名，它在細胞周期G1期開始升高，S期合成達到高峰，M期降至最低。PCNA參與DNA的合成，凡處于增殖期的細胞、組織均可檢出PCNA的陽性表達，而處于靜止狀態的細胞、組織PCNA表達則為陰性，其變化與DNA的合成相一致，因此檢測PCNA含量可間接反映局部細胞、組織的增殖狀態[10,12]。VEGF又名血管通透因子，由角蛋白細胞分泌，是血管內皮細胞的特異性有絲分裂原，是一種促血管生成的主要調節因子，它通過血管內皮生長因子受體轉導其促血管生成的信號，促使血管通透性增加及血管內皮細胞增生、遷移，最終導致新生血管形成，對血管生成具有重要作用，是迄今發現的最強的促進血管內皮細胞增殖、遷移及誘導血管生成的因子[13,14]。CD31主要存在于內皮細胞表面，可反映血管增殖變化及組織形態變化[15,16]。

針對國內外研究發現PCNA、VEGF和CD31是與銀屑病皮損病理學相關的基因[3,17]。PCNA、VEGF和CD31在銀屑病小鼠皮損處過度表達，會促進表皮細胞過度增殖、角化不全、加速血管增生及增加血管的滲透性，誘發炎癥細胞的遷移，從而加重銀屑病皮損處的炎癥反應，促進銀屑病的病理進程，因此降低PCNA、VEGF和CD31在銀屑病小鼠皮損處的表達，可能成為銀屑病的治療靶點。

消銀湯應用于銀屑病治療發現它具有改善病情、延長緩解期、不良反應小及防止復發的特點[18,19]。綜上所述，本實驗研究制備銀屑病模型小鼠，通過消銀湯高、中、低劑量治療，觀察小鼠皮損處表皮厚度、真皮炎癥細胞浸潤度、PCNA、VEGF和CD31的蛋白及mRNA表達水平，探索消銀湯治療銀屑病的作用機制及臨床療效。實驗研究發現不同劑量的消銀湯能不同程度地抑制銀屑病模型小鼠背部皮損的角質細胞過度增殖、真皮乳頭層微血管擴張迂曲；能降低小鼠皮損組織、血清中PCNA、VEGF和CD31的蛋白及mRNA水平，高、中、低劑量組差異均有統計學意義(P<0.05)，說明：消銀湯能通過下調PCNA、VEGF和CD31的蛋白及mRNA表達水平，明顯改善銀屑病小鼠的臨床癥狀，為消銀湯的臨床推廣用藥和指導其臨床用藥具有重要意義。