海洛因對大鼠額葉、海馬區泛素蛋白酶體功能的影響

【摘 要】目的：觀察海洛因對大鼠額葉和海馬區腦組織形態學改變及Ub、UbE1在腦組織中的表達，探討海洛因對中樞神經系統功能和形態的影響及其發生機制。方法：選擇SD大鼠，分為3組（短時組2w、長時組4w及正常對照組），首日每次皮下注射海洛因3mg/kg，每天2次，逐日按3mg/kg遞增海洛因注射量，連續9天（第9天每次劑量達27mg/kg），第10天用5.0mg/kg納洛酮腹腔注射，誘發戒斷癥狀，對海洛因成癮大鼠模型戒斷癥狀進行評分；對照組按同樣方式注射等量生理鹽水。采用免疫組織化學方法分別檢測Ub、UbE1在神經元中的表達變化。結果：Ub和UbE1主要表達在神經元細胞核、細胞質內，細胞外未見表達。圖像分析顯示Ub、UbE1的表達量均為海洛因長時依賴組（4w）<海洛因短時依賴組（2w）<非海洛因依賴組，差別具有統計學意義（P<0.05）。結論：海洛因中毒可引起腦組織形態學改變，表現為神經元數量減少、神經元變性等，其機制可能與泛素蛋白酶體功能障礙有關。

【關鍵詞】海洛因；大鼠額葉；中樞神經系統；泛素-蛋白酶體系統

海洛因（heroin），化學名為二醋嗎啡，是成癮性極強的嗎啡衍生物。大量人群流行病學、動物實驗研究結果均表明[1，2，3]，海洛因依賴可導致廣泛神經元變性壞死、萎縮退化及脫髓鞘改變；臨床上大多有智能減退， 表現為計算力、理解力、定向力、記憶力、判斷力減退， 甚至癡呆。因此，近年來認為海洛因依賴也屬于一種與記憶、癡呆癥相關的慢性、復發性神經變性疾病[4]。

泛素-蛋白酶體系統（ubiquitin-proteasome system，UPS）是機體修復或消除異常蛋白質的重要途徑，在神經變性疾病中發揮著重要作用。近幾年來，隨著UPS的分子機制研究取得的巨大的進展，UPS在神經變性疾病的發病機制中的作用也得到了許多研究的肯定。UPS功能的缺陷，無論是UPS水平的過高還是過低，都可能導致神經變性疾病的發生。國內外對于海洛因成癮及復吸所引起的神經損害是否也受UPS的調控尚未見報道。本文通過建立海洛因依賴大鼠模型，研究Ub、UbE1在大鼠額葉、海馬區表達水平的變化，探討海洛因致腦損傷機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SD大鼠30只，購自貴州醫科大學實驗動物中心。3月齡，體重200-220g，雌雄各半。

1.2 藥品和試劑

海洛因由貴州省公安廳提供。泛素（Rabbit Anti-Ubiquitin）、泛素激活酶（Ubiquitin-activating enzymel， UbE1）購自北京博奧森公司；生物素化二抗（山羊抗兔IgG）購自北京博奧森公司，其余試劑為國產分析純。

1.3 動物模型

經過適應性喂養一周后，按體重及性別隨機分為3組，每組10只，長時組（皮下注射海洛因4w），短時組（皮下注射海洛因2w），正常對照組（皮下注射等量生理鹽水），飼養期分別為2周和4周，參照以往文獻成功復制海洛因依賴模型的方法[5]，給予SD大鼠海洛因皮下注射，首日每次劑量3mg/kg，每天2次，逐日按3mg/kg遞增海洛因注射量，連續9天（第9天每次劑量達27mg/kg）。對照組按同樣方式注射等量生理鹽水。每天觀察動物生長發育狀況及體重變化情況。第10天用5.0 mg/kg納洛酮腹腔注射，誘發戒斷癥狀觀察30min，對海洛因成癮大鼠模型戒斷癥狀進行評分，確認海洛因依賴模型成功。短時組繼續皮下注射27mg/kg海洛因4天（共計2周），每天2次；長時組繼續皮下注射27mg/kg海洛因18天（共計4周），每天2次。生理鹽水對照組各5只大鼠分別采用與模型組相同劑量的生理鹽水注射2周、4周。

1.4 動物行為變化觀察

觀察大鼠毛色、飲食、活動情況、精神狀態，用電子秤稱量大鼠體重。參照Seebers等評分標準，進行大鼠催促戒斷癥狀評分。

1.5 取材和標本制備

各組大鼠分別用戊巴比妥腹腔注射麻醉，灌注4%的甲醛溶液固定，參照鼠腦立體定位圖譜冠狀取海馬區、前額葉皮質組織（包含周邊組織）。

1.6 HE染色和尼氏染色

多聚甲醛固定，石蠟包埋組織連續切片，片厚4μm，取海馬、前額葉皮質腦組織切片，進行常規HE染色，參照周君[6]的方法進行尼氏染色，略有改動。

1.7 免疫組織化學Envision法

切片常規脫蠟至水，0.01mol/L枸緣酸鈉緩沖溶液（PH6.0）微波抗原修復，蒸餾水洗2min，PBS沖洗3次，5min/次，3%H2O2室溫避光孵育10 分鐘，除去內源性過氧化氫酶，蒸餾水洗2min，PBS沖洗3次，5min/次，胰酶（1：1稀釋）37℃恒溫箱中消化20min，使抗原位點暴露，蒸餾水洗2min，PBS沖洗3次，5min/次，分別滴加一抗多克隆Ub、UbE1 （用PBS稀釋1：100、1：100），4℃冰箱孵育過夜，復溫，PBS沖洗3次，5min/次，滴加兔二抗IgG（PV6001），37℃孵育30min，PBS沖洗3次，5min/次，DAB液顯色，蘇木精輕度復染，常規脫水、透明、封片。1.8 圖像分析

通過Biomias 2000 圖像分析系統進行計算分析，具有陽性表達的區域隨機選取4個視野，每個視野隨機選取陽性表達部位進行平均灰度值測定，平均灰度高則表達強，反之則弱。

1.8 統計方法

運用SPSS 19.0統計軟件數據包進行數據分析，用均數±標準差（D）表示，兩組間的比較采用獨立樣本T檢驗的分析方法，*P<0.05表示與對照組相比差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 海洛因依賴戒斷大鼠模型評分、體重

大鼠在9d皮下注射遞增劑量的海洛因后，用納洛酮催促后30min內出現了濕狗樣顫抖、伸展、清理皮毛、吞咽、站立、扭體、齒顫、上瞼下垂、流涎等戒斷癥狀，對戒斷癥狀進行評分，短時組評分18.1±2.1，差異有統計學意義（P<0.01），長時組評分23.5±2.4，差異有統計學意義（P<0.01），正常對照組評分2.8±1.5，差異無統計學意義。短時組催促戒斷癥狀前體重230.4±15.1，戒斷后體重197.7±18.3，體重明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）；長時組催促戒斷癥狀前體重225.6±13.9，戒斷后體重186.7±16.7，體重明顯下降，差異有統計學意義（P<0.05）；對照組催促戒斷癥狀前體重265.9±19.7，戒斷后體重265.8±21.1，體重無明顯改變。

2.2 HE染色及尼氏染色

海洛因依賴組（包括短時組和長時組）前額葉、海馬區都出現正常神經元數量減少、神經元變性（包括神經元固縮、深染、偏位，細胞核仁消失，尼氏體減少）、膠質細胞增生、膠質小結形成、嗜神經現象等形態學改變，而對照組少見上述改變。尼氏染色顯示海洛因依賴組Nissl小體數量減少（P<0.05），且海馬區和前額葉皮質均隨用藥時間延長Nissl小體減少更明顯（P<0.05）。

2.3 Ub免疫組織化學染色觀察

Ub陽性表達廣泛存在于前額葉皮質及海馬區神經元的細胞質和細胞核中，免疫組織化學定量分析可見：長時組<短時組<對照組，統計有顯著差異，P<0.05；前額葉皮質及海馬區陽性表達比較，無統計學意義，見圖1。

2.4 UbE1免疫組織化學染色觀察

UbE1陽性表達廣泛存在于大腦皮質及海馬神經元的細胞質和細胞核中，細胞外未見表達，免疫組織化學定量分析可見：長時組<短時組<對照組，統計有顯著差異，P<0.05；前額葉皮質及海馬區陽性表達比較，無統計學意義，見圖2。

3 討論

海洛因容易通過血腦屏障直接作用于腦細胞，產生毒性作用。研究發現，海洛因依賴死者生前均出現不同程度的反應遲鈍、情感淡漠、注意力不集中、懶言少語等表現，與阿爾茨海默病、帕金森癥等神經變性疾病癥狀相似[3，7]。死亡病例腦組織病理學檢查可見不同程度的彌漫性神經細胞變性壞死、嗜神經現象多見，可見淀粉樣小體、膠質細胞增生等[3]。

本試驗通過海洛因遞增皮下注射成癮、催促戒斷癥狀法建立海洛因依賴大鼠模型，腹腔注射5.0 mg/kg納洛酮后，大鼠出現明顯的濕狗樣顫抖、伸展、清理皮毛、吞咽、站立、跳躍、齒顫、上瞼下垂、流涎等癥狀，且體重急劇下降，與人使用海洛因后產生的戒斷癥狀相似。本試驗通過HE、尼氏染色發現，海洛因依賴大鼠前額葉、海馬區都出現正常神經元數量減少、神經元變性、膠質細胞增生、膠質小結形成、嗜神經現象、Nissl小體數量減少等形態學改變，該研究與以往的研究結果相一致[3，5]，肯定了海洛因對腦組織的損害作用，提示海洛因依賴對腦組織的損傷以神經元變性、壞死為主，可能與海洛因引起呼吸抑制致全身缺氧，進而造成大量脫髓鞘改變及神經元變性有關。

泛素蛋白降解系統是細胞內一系列生命進程的重要調節方式，與疾病的發生發展關系密切。它主要由泛素、泛素啟動酶（包括泛素激活酶、泛素結合酶、泛素連接酶）、26S蛋白酶體和去泛素化酶組成。泛素蛋白酶體系在高等真核生物細胞中的功能主要體現在兩個方面：一方面降解細胞內的蛋白，另一方面是非降解作用，調節細胞內不同蛋白的定位和活性[8]。泛素活化酶1（ubiquitin-activating enzyme 1，UbE1）可以活化所有參與結合反應的泛素，并將活化泛素轉移到E2酶。張利達[9]等對脫毒大鼠針刺百會和大椎治療發現，減少神經細胞凋亡，調節大鼠海馬、中腦腹側背蓋區（VTA）的Ub、E3、26s mRNA和蛋白的表達，可干預海洛因致腦損傷作用。本研究觀察海洛因依賴大鼠腦組織中Ub、UBE1廣泛定位于神經元細胞質和細胞核中，甚至在軸突和樹突中也有表達，應用圖像分析陽性信號顯示，Ub、UBE1在海洛因依賴長時組、短時組中表達水平均較正常對照組有不同程度的降低（p<0.05）。目前已知，蛋白質的多泛素化是一種控制信號，凡被Ub標記的蛋白質最終被降解。一些易聚集蛋白（如Tau蛋白、α-Synuclein、淀粉樣前體蛋白等）有纖維狀的形態學特點，不易被相應的酶降解，并且異常蛋白的增加和腦內的聚集在神經變性疾病的發病機制中起著關鍵作用，可對神經元產生毒性作用[10]。泛素蛋白酶體系統具有識別這類多余的和錯誤折疊的蛋白質，以保持細胞內蛋白質平衡的作用，UbE1失活和泛素化水平功能障礙是致死性的。由實驗結果可見，海洛因依賴成癮可致額葉、海馬區腦組織的UbE1表達量減少，且泛素化水平降低，可以推測泛素蛋白酶體系功能紊亂可能是海洛因對大鼠成癮復吸或腦組織損害的原因之一。

（通訊作者：汪元河）

參考文獻

[1]蔡興慧，宋小鴿，張榮軍.針刺對海洛因復吸大鼠腦神經元超微結構變化的影響[J].中國藥物依賴性雜志，2012，21（01）：26-29.

[2]黃仕美，臧貴勇，王杰等.吸食海洛因死亡60例法醫學分析[J].貴陽醫學院學報，2013，38（02）：203-205.

[3]劉碧萱.海洛因依賴患者戒斷期臨床表現以及非替代治療療效觀察與分析[J].中國醫藥指南，2011，9：103-104.

[4]劉天明.21例海洛因中毒性神經系統損害臨床分析[J].中國工業醫學雜志，2011，24（01）：25-26.

[5]胡赟，梁文妹，李一欣等.海洛因依賴大鼠頜下腺IL-1、TNF表達的改變[J].實驗動物科學，2017，34（06）：1-5.

[6]周君，陳勤.神經細胞尼氏體染色方法改良[J].生物學雜志，2010，27（05）：94-95.

[7]劉徽婷，王嘉軍.海洛因依賴者神經一內分泌一免疫功能損傷[J].中國藥物依賴性雜志，2009，18（01）：10-12.

[8]袁莉剛，趙興緒，劉英.泛素-蛋白酶體通路在神經系統中的生物學功能[J].中國獸醫科學，2007，37（05）：444-448.

[9]張利達，曹江鵬，蔡興慧等.針刺調控泛素蛋白酶體途徑對干預海洛因腦損傷的影響[J].針灸推拿醫學 英文版，2018，2：80-88.

[10]劉英華，羅健東.蛋白酶體活性抑制對大鼠海馬tau蛋白的泛素化影響[J].實用醫學雜志，2011，27（03）：386-389.

作者簡介

黃仕美（1982-），女，貴州省貴陽市人。碩士學位。貴州醫科大學法醫學院講師，兼主檢法醫師。主要研究方向為神經病理。