缺氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機(jī)制研究

李亞博，王 佩，陳 一，楊松柏*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033;2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科)

心肌功能障礙可由于心肌缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡造成，常見的有心力衰竭、心肌梗塞(MI)等[1]。因此，研究缺氧時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)在機(jī)體中的作用機(jī)制，對人類心血管疾病的診治具有重要意義。內(nèi)皮細(xì)胞在缺氧的情況下會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，包括細(xì)胞增殖、遷移、炎癥和凋亡[2]。細(xì)胞凋亡若發(fā)生于心肌內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，將會(huì)導(dǎo)致一些心臟疾病[3]。因此，研究血管內(nèi)皮細(xì)胞(VECs)缺氧誘導(dǎo)分化的分子機(jī)制對了解心血管疾病的發(fā)病機(jī)制及診療新方案的發(fā)掘具有重要意義。

1 材料與方法

1.1人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)是從中國科學(xué)院細(xì)胞庫購買的。在治療前，通過過夜血清饑餓使細(xì)胞靜止。

對照siRNA和SP-1 siRNA，在游離EGM-2中生長至70%-80%融合后，用對照siRNA或SP-1 siRNA轉(zhuǎn)染HUVECs。培養(yǎng)5 h后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)化為完整培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜。然后，細(xì)胞暴露在正?；蛉毖醐h(huán)境中。最后經(jīng)western blot檢測證實(shí)SP-1表達(dá)下調(diào)。miR-135 b模擬或miR-135 b抑制劑轉(zhuǎn)染到HUVECs。轉(zhuǎn)染48 h后，取細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.2 細(xì)胞增殖使用MTT檢測試劑盒(Sigma,St.Louis,USA)根據(jù)制造商協(xié)議檢測細(xì)胞增殖。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)轉(zhuǎn)染48 h后，室溫下，用FITC-Annexin V和碘化丙酸鈉在暗處染色15 min，觀察細(xì)胞凋亡情況。然后,細(xì)胞凋亡的比例由流式細(xì)胞術(shù)檢查分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。組間比較采用GraphPad Prism 6和one-way ANOVA分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧HUVECs細(xì)胞SP-1和miR-135b的表達(dá)Western印跡和qRT-PCR結(jié)果顯示SP-1在HUVEC中的表達(dá)隨著缺氧時(shí)間的延長而增加(圖1，表1)。缺氧暴露的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞miR-135b水平降低(圖1，表1)。提示轉(zhuǎn)錄因子SP-1和miR-135b可能參與了缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷。

2.2 SP-1的缺失影響缺氧條件下HUVECs細(xì)胞的增殖和凋亡將SP-1 siRNA轉(zhuǎn)染于缺氧暴露的HUVECs中，觀察SP-1的作用，SP-1表達(dá)明顯下降(圖2A)。MTT法顯示缺氧條件下細(xì)胞增殖下降。然而，si-SP-1轉(zhuǎn)染上調(diào)細(xì)胞增殖(圖2B)。缺氧增加細(xì)胞凋亡率，si-SP-1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率降低(圖2C)。這些結(jié)果表明，SP-1的損失可能會(huì)減弱缺氧對HUVECs細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

2.3 SP-1的缺失可以減弱缺氧誘導(dǎo)的炎癥因子和VEGF的表達(dá)粘附分子VCAM-1、ICAM-1、VEGF表達(dá)升高在血管內(nèi)皮損傷中起關(guān)鍵作用。在研究中，缺氧增加了VCAM-1、ICAM-1和VEGF的表達(dá)，而SP-1的損失降低了HUVECs中VCAM-1、ICAM-1和VEGF的表達(dá)(與對照組比較，P<0.05)。此外,血清炎癥因子水平TNF-α,IL-1β,il - 6,以及活性氧的生產(chǎn),也顯著增加;但是si-SP-1降低(與對照組比較，P<0.05)。這些結(jié)果表明，SP-1的缺失降低了缺氧暴露HUVECs中炎癥因子和VEGF的表達(dá)。

2.4 SP-1 siRNA缺失轉(zhuǎn)染到缺氧暴露的HUVECS中增加miR-135b表達(dá)和減少HIF-1α表達(dá)HIF-1α、缺氧的關(guān)鍵響應(yīng)要素密切參與血管內(nèi)皮損傷引起的組織缺氧。發(fā)現(xiàn)HUVECs缺氧增加HIF-1α但si-SP-1轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)(表2)。缺氧可降低miR-135b的表達(dá)，而丟失SP-1可增加HUVECs中miR-135b的表達(dá)(表2)。這些結(jié)果表明,sp 1損失增加miR-135b和降低HIF-1α表達(dá)缺氧誘導(dǎo)HUVECs。

2.5 SP-1/miR135b/HIF-1α是HUVECs缺氧損傷的一種新軸為了探討SP-1在缺氧誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)miR-135b可抑制HIF-1α蛋白的表達(dá)，而抗miR-135b可增加HIF-1α蛋白的表達(dá)，這些結(jié)果表明miR-135b直接靶向HIF-1α。

圖1 缺氧暴露下HUVECs中SP-1和miR-135b的表達(dá)情況 western blot檢測缺氧人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中SP-1蛋白的表達(dá)，RT-qPCR檢測缺氧HUVECs中miR-135b水平

表1 缺氧暴露下HUVECs中SP-1蛋白和miR-135b相對表達(dá)水平

與對照組(0 h)比較，*P<0.05。

圖2 SP-1的缺失影響缺氧下HUVECs細(xì)胞的增殖和凋亡 (A)Western blot檢測SP-1表達(dá);(B)MTT法檢測細(xì)胞增殖;(C)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

結(jié)果平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。與對照組比較，*P<0.05。與缺氧+si-SP-1組比較，#P<0.05

表2 SP-1 siRNA轉(zhuǎn)染到缺氧暴露的HUVECs中HIF-1α蛋白和miR-135b相對表達(dá)水平

3 討論

本實(shí)驗(yàn)意在探究血管內(nèi)皮細(xì)胞(VECs)在缺氧誘導(dǎo)分化的分子機(jī)制，采用缺氧誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)模擬缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷。缺氧條件下HUVECs表達(dá)SP-1。SP-1siRNA轉(zhuǎn)染缺氧培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后，細(xì)胞增殖減少，炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和活性氧生成增加。研究發(fā)現(xiàn)，Si-SP-1轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)了所有這些效應(yīng)。此外研究還發(fā)現(xiàn)，抗miR-135b或HIF-1α激動(dòng)劑CoCl2可抑制si-SP-1對缺氧培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的作用。缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是心肌梗塞、冠心病等心血管疾病(CVD)的病理生理機(jī)制的重要因素[4]。若缺氧部位發(fā)生于心肌細(xì)胞，心肌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙參與了幾種CVD的發(fā)病機(jī)制[5]。因血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)直接與血液接觸，因此它們對缺氧刺激作出迅速反應(yīng)。越來越多的研究證據(jù)表明，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受缺氧誘導(dǎo)的心血管損傷至關(guān)重要[6]。據(jù)報(bào)道，轉(zhuǎn)錄因子SP-1對調(diào)節(jié)與細(xì)胞功能相關(guān)的細(xì)胞因子很重要。SP-1的抑制已被證明可以減少HIF-1α對上皮細(xì)胞的影響[7]。缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的調(diào)節(jié)參與血管內(nèi)皮損傷。我們發(fā)現(xiàn)沉默SP-1能減輕缺氧誘導(dǎo)的HUVECs損傷[8]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低氧暴露后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥表型ICAM-1、VCAM-1蛋白水平及TNFα、IL-6和IL-1β分泌增加。此外，細(xì)胞內(nèi)ROS生成增加可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能的氧化應(yīng)激和細(xì)胞功能的喪失[9]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)在低氧暴露HUVECs中ROS產(chǎn)生增加，并且沉默SP-1對低氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。miRNA也是心肌缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。我們的研究表明，在缺氧條件下HUVECs中miR-135b表達(dá)降低。因此，我們推測miR-135b可能參與了缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SP-1的沉默上調(diào)了缺氧條件下HUVEC中miR-135b的表達(dá)，表明SP-1可能通過miR-135b影響HUVEC。miR135b靶向HIF-1α。我們的結(jié)果證實(shí)miR-135b通過直接靶向調(diào)節(jié)HIF-1α。

總之，在我們的研究中，低氧使臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的SP-1水平升高。缺氧暴露可增加HUVECs凋亡、炎癥和活性氧的產(chǎn)生，減少HUVECs的增殖。然而，缺氧對HUVECs的這些作用在用SP-1siRNA轉(zhuǎn)染后均被逆轉(zhuǎn)。此外，我們發(fā)現(xiàn)SP-1能負(fù)性調(diào)節(jié)miR-135b的表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)miR-135b的靶基因，HIF-1α是miR-135b的靶基因。因此，SP-1/miR-135b/HIF-1α軸可能在缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷中起重要作用。因此，我們的研究對心血管疾病的發(fā)病機(jī)制及診療新方案的發(fā)掘具有重要意義。