粒細胞集落刺激因子對心肌梗死后BCL-XL表達的影響

包哈申，胡斯楞

（內蒙古錫林郭勒盟醫院，內蒙古 錫林浩特 026000）

細胞凋亡是指由基因控制的自主的、有序的、主動的細胞死亡過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控。急性心肌梗死后不僅因缺血壞死而喪失大量的心肌細胞，細胞凋亡也同樣造成大量心肌細胞的丟失[1]。有研究報道在AMI模型大鼠，心肌細胞凋亡與缺血壞死比例可高達30:1，大量功能正常的心肌細胞凋亡可造成心臟收縮功能減退、心室壁變薄、心室擴張等病理性改變而加速心肌梗死后心室重構的進展[2]。本研究旨在探討G-CSF對心肌梗死后心肌細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

昆明種小鼠150只，雌雄不限，購自北京維通利華實驗動物有限公司。鹽酸異丙腎上腺素（東京化成工業株式會社），人重組粒細胞刺激因子注射液（北京四環生物制藥），兔TGF-β1多克隆抗體（protein tech公司），Kit-9710即用型免疫組化試劑盒（福州邁新），DAB顯色試劑盒（福州邁新生），磷酸鹽緩沖液，MD4000 B LED顯微鏡（Lecia公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模

鹽酸異丙腎上腺素85 mg/kg連續腹腔注射3天誘導AMI模型。造模后第1天10%水合氯醛4.5 ml/kg腹腔注射麻醉小鼠，采集Ⅱ導聯心電圖。以J點顯著上抬作為初步判斷造模成功的標準，以J點上臺＜0.2 mV作為排除標準。隨機選取心電圖符合上述標準的模型動物10只，行心肌HE染色觀察心肌組織結構改變，進一步判斷造模是否成功。

1.2.2 分組

將模型小鼠隨機分成A、B、C三組，再取10只正常小鼠作為D組。A組：AMI組，30只；B組：AMI+G-CSF中劑量組，G-CSF 50 ug/kg連續腹腔注射5天，20只；C組：AMI+G-CSF高劑量組，G-CSF 100 ug/kg連續腹腔注射5天，20只；D組：對照組，10只。A組分別于造模后第1、14、28天采血并各處死三分之一，B、C組分別于造模后第14、28天采血并各處死一半。

1.2.3 血清學檢測

斷頸法處死小鼠，迅速打開胸腔取出心臟，置于10%福爾馬林液固定24小時以上，行心肌BCL-XL免疫組化。光學顯微鏡下觀察BCL-XL的表達量及分布況，每只小鼠每組免疫組化在相同的顯微鏡參數下隨機采集3張圖片，采用Image pro plus 6.0圖像軟件計算BCL-XL的平均光密度，并進行組內及組間對比。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件對數據進行處理，計量資料以“x±s”表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

與D組相比較，造模后第1天A組BCL-XL平均光密度顯著上升，差異有統計學意義（P＜0.05）。

第14天時，與A組第1天比較A、B、C三組BCL-XL平均光密度均顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。A、B、C三組間比較，BCL-XL平均光密度差異無統計學意義（P＞0.05）。

第28天時，與第14天比較A、B兩組BCL-XL平均光密度均顯著地上升，差異有統計學意義（P＜0.05），而C組BCL-XL平均光密度輕度下降，差異無統計學意義（P＞0.05）。A、B、C三組間比較，A組BCL-XL平均光密度均顯著大于B組與C組，差異有統計學意義（P＜0.05），B組BCL-XL平均光密度均顯著大于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組BCL-XL平均光密度比較（±s，%）

表1 各組BCL-XL平均光密度比較（±s，%）

注：*與D組比較，P＜0.05。**與A組1 d比較，P＜0.05。#與14 d時比較，P＜0.05。##與A組28 d比較，P＜0.05

組別 數量（只） BCL-XL平均光密度A組1 d 10 0.027±0.0065*A組14 d 10 0.018±0.0028**A組28 d 9 0.038±0.0084#B組14 d 10 0.015±0.0057**B組28 d 10 0.027±0.0091###C組14 d 10 0.016±0.0034**C組28 d 10 0.015±0.0034##D組 10 0.011±0.0021

3 討 論

李陶等[3]對心肌梗死后心肌細胞凋亡進行了深入的研究，并報道大鼠AMI模型誘導后第1天AMI組心肌細胞凋亡率較假手術組顯著升高，心肌細胞凋亡主要分布在梗死區及梗死周邊區，而遠端非梗死區只占7%。隨著時間的推移遠端非梗死區心肌細胞凋亡占主導地位，4周后其分布率達54%，心肌細胞凋亡率也由4周前的（0.07±0.03）%上升至（0.09±0.05）%，遠端非梗死區心肌細胞凋亡率與左心室舒張末徑之間存在正相關性，認為遠端非梗死區心肌細胞凋是心肌梗死后心室重構及心功能惡化的重要原因之一。遠端非梗死區心肌細胞凋亡主要與心肌細胞牽張力及壓力負荷增高、炎性細胞因子的釋放、神經體液機制的激活等有關，其中AngⅡ也參與了心肌梗死后心肌細胞凋亡過程。田翠等[4]研究發現，AngⅡ與心肌細胞AT1結合開放電壓依賴性L型鈣通道，促使大量鈣離子內流激活鈣依賴性核酸內切酶，鈣依賴性核酸內切酶切割心肌細胞DNA雙鏈導致心肌細胞凋亡。

本研究未直接觀察心肌梗死后心肌細胞凋亡情況，而是通過抗凋亡蛋白BCL-XL在心肌中的表達量來間接反映了心肌細胞凋亡情況。崔巍等[5]在結扎犬冠狀動脈左前降支30分鐘后觀察到抗凋亡蛋白BCL-XL表達量較對照組明顯增高，并認為心肌細胞凋亡是急性心肌缺血的早期病理改變，心肌急性缺血時抗凋亡蛋白BCL-XL表達量迅速增高以對抗心肌細胞凋亡。本實驗同樣也觀察到了造模后第1天AMI組心肌BCL-XL蛋白表達量較正常對照組顯著升高，提示AMI后早期就有大量心肌細胞凋亡。第28天AMI組BCL-XL蛋白表達量再次升高，可能與AMI晚期非梗死區心肌細胞凋亡增高有關，表明AMI后心肌細胞凋亡持續存在，而過量表達的抗凋亡蛋白BCL-XL被凋亡蛋白Caspase降解成有促凋亡作用的片段，可能會進一步加重AMI晚期心肌細胞凋亡。值得注意的是，G-CSF抑制心室重構、改善心功能的作用機制與G-CSF通過激活Jak/Stat3信號通路調控抗凋亡蛋白BCL-XL、BCL-2與凋亡蛋白Bad、Bax之間的相互作用，進而減少心肌細胞凋亡有關。G-CSF干預后高劑量給藥組BCL-XL表達量持續下降，而中劑量給藥組BCL-XL表達量造模后第28天與造模后第14天比較有所上升，但仍低于AMI組，第28天G-CSF高劑量給藥組BCL-XL表達量顯著低于G-CSF中劑量給藥組，提示G-CSF高劑量組抑制心肌梗死后晚期心肌細胞凋亡作用可能優于G-CSF中劑量組。綜上所述心肌細胞凋亡是心肌梗死后心室重構的重要組部分，G-CSF干預可顯著而持久的抑制心肌梗死后心肌細胞凋亡。