成年大鼠脊髓損傷模型音猬因子的表達研究

音猬因子是胚胎發育過程中脊索產生的一種神經調控因子，其對神經管腹側結構的形成、發育與分化有所影響[1]。近年來的研究發現，音猬因子在神經軸突損傷后修復和再生過程中有活躍表現，并且在很多神經性疾病中音猬因子信號也有重要作用，有實驗證實音猬因子信號可以對瀕死的神經元具有顯著的營養和保護作用來延緩神經元壞死等[2-3]。為進一步探討音猬因子表達和神經損傷以及神經發育的關聯性展開本組研究。

1 材料與方法

1.1 材料來源：從實驗室飼養大鼠中選取30只符合納入標準的成年大鼠為研究對象，均為常規環境下飼養的健康大鼠。

1.2 納入標準：①均為成年健康大鼠，體質量220～250 g。②雌雄不限。

1.3 處理方法：將30只大鼠分為兩組，其中5只僅咬除椎板作為空白組，其余25只制作脊髓損傷模型。造模方法：25只大鼠按照標準0.3 mL/100 g腹部注射10%水合氯醛；參考Allen's打擊法進行脊髓損傷模型制作，麻醉完成后大鼠取俯臥位并固定四肢，影像學設備輔助下確定大鼠脊髓T10節段，做縱向切口，使皮下組織、筋膜、肌肉、棘突暴露，使用咬骨鉗咬除T10節段對應棘突和椎板，并制作圓形骨窗，使脊髓硬膜囊暴露。使用墊片覆蓋T10脊髓，從25 mm高度自由落下重10 g克氏針對脊髓進行沖擊，形成損傷。觀察到對應部位出現充血、水腫且下肢迅速回縮、尾巴翹起、大鼠迅速倒下時則可認定為脊髓損傷模型制作完成。

1.4 行為學評估：分別于模型制作完成后第1、3、5、7、14天時取5只大鼠進行行為學評估。主要觀察項目為大鼠脊髓損傷后不同時間點肢體功能恢復情況，以此為依據評估脊髓神經功能恢復情況。采用BBB評分和斜板試驗進行行為評估，斜板試驗為使大鼠身體軸線和斜板縱軸垂直后不斷調整斜板坡度，以大鼠能夠在斜板上停留5 s的最大坡度為其肢體功能評分。

1.5 音猬因子檢測方法：使用免疫組織化學技術檢測音猬因子表達，顯微鏡下檢測脊髓組織免疫組化染色后音猬因子的表達。音猬因子mRNA檢測及半定量采用原位雜交技術。利用高清晰彩色病理圖像分析系統對音猬因子表達進行圖像分析，選取視野內陽性反應細胞并進行半定量分析。根據原位雜交信號強度和分布情況確定4個等級，分別為無信號（-）、低信號（+）、中等信號（++）、高信號（+++）。

1.6 統計學方法：使用SPSS14.0軟件對數據進行統計學處理，計量資料平均數±標準差（±s）表示，經t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 行為學評估：脊髓損傷模型下的5只大鼠出現不同程度的后肢力量減弱、行走緩慢、步態異常，與空白組比較存在差異，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 模型制作完成后第1、3、5、7、14天進行行為學評估結果（

表1 模型制作完成后第1、3、5、7、14天進行行為學評估結果（

脊髓損傷組斜板試驗評分脊髓損傷第1天 21 1.1±0.2 65.0±4.1 32.1±3.5脊髓損傷第3天 21 2.1±0.3 65.1±3.6 34.3±3.6脊髓損傷第5天 21 2.6±0.4 65.3±3.2 36.2±3.9脊髓損傷第7天 21 3.2±0.5 65.7±3.9 38.8±4.2脊髓損傷第14天 21 6.1±0.7 65.8±3.8 42.9±4.5組別 空白組BBB評分脊髓損傷組BBB評分空白組斜板試驗評分

根據表中統計結果可以發現，空白組大鼠BBB評分和斜板試驗評分隨時間推移整體變化值較小，而脊髓損傷模型大鼠的對應評分則隨著時間推移不斷改善，這提示隨著時間的推移脊髓損傷模型下的成年大鼠脊髓功能逐漸恢復。

2.2 音猬因子表達檢測結果：通過免疫組化檢查，脊髓損傷模型后第3天觀察到音猬因子蛋白開始表達。脊髓損傷模型制作第1天后，取5只成年大鼠進行音猬因子mRNA檢測，發現可見音猬因子表達低信號，范圍較為局限，僅在脊髓灰質區域內，白質區域內未檢測到音猬因子mRNA，表達信號為-。脊髓損傷模型制作第3天后，取5只成年大鼠進行音猬因子mRNA檢測，可同時檢測到音猬因子表達中等信號和低信號。損傷區內音猬因子表達為中等信號，損傷區遠端10 mm處音猬因子表達為低信號。隨后在脊髓損傷模型制作后的第7天，音猬因子mRNA表達水平在損傷區遠端10 mm處的灰質和白質中表達達到最大值，可見高信號，通過染色后鏡下觀察，發現在少突膠質細胞中音猬因子表達水平最高，室管膜區域內音猬因子mRNA表達僅存在于損傷區域的5 mm范圍內，分布區域較小。而在空白組的5只大鼠中，全時間段均未見到音猬因子mRNA表達。同時在免疫組化檢測中，僅少突膠質細胞中存在音猬因子表達，而星形膠質細胞中則未見音猬因子表達。

3 討 論

根據相關研究報道[4-5]，可以確定音猬因子是脊髓腹側神經干細胞分化過程中的活躍成分，從某種意義上來說音猬因子決定了胚胎期神經細胞的增殖和分化方向，是神經系統再生的重要元素[6]。

在本組研究中，共準備了30只成年健康大鼠為研究樣本，共制作了5只空白組和25只脊髓損傷模型組，同時從行為學評估、免疫組化和音猬因子mRNA檢測3個方面對空白組和脊髓損傷模型組進行評價。得到以下結論：①隨著時間的推移，音猬因子表達強度由低到高，與大鼠肢體功能恢復周期相吻合。②音猬因子表達的最高信號在損傷區域內遠端10 mm和少突膠質細胞中，星形膠質細胞中未見音猬因子表達。③音猬因子表達并非脊髓損傷后立即出現，從出現到達到高信號有一定時間差。

因此綜上所述，音猬因子表達和脊髓神經功能再生有密切聯系，極有可能與神經再生有關，如果想要完全確認音猬因子和脊髓損傷后神經功能再生的關聯性，需要進一步研究，但不可否認脊髓損傷是激活音猬因子表達的重要條件。