鎖陽含藥血清對MC3T3-E1成骨細胞增殖分化及礦化的影響

武海燕，張靈莉，馮雪梅

鎖陽，性甘，溫，歸肝，腎，大腸經。具有補腎陽，益精血，潤腸通便的作用。可用于治療腎陽不足，精血虧虛，腰膝痿軟，陽痿滑精，腸燥便秘等病癥[1]。明代《本草綱目》記載:“鎖陽性溫，補腎，益精血，潤燥養精治痿弱”。《本草原始》: “鎖陽補陰血，祛虛火，興陽固精，強陽易髓”。《中藥志》:“補腎，滑腸，強腰膝，主治男子陽痿。”現代藥理學研究表明，鎖陽含有含有糖和糖苷類、黃酮類、萜類、甾體類等多種化學成分，具有增強性功能、增強機體免疫力、抗氧化等藥理作用[2～3]。本實驗通過體外培養成骨細胞加入鎖陽含藥血清進行干預，觀察其對成骨作用的影響，為鎖陽與骨形成發育的關系提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

體重18～22 g 的SPF級昆明小鼠64只，（實驗動物許可證號：SCXK(川)2015-030）雌雄各半，隨機分為四組，每組16只，分別為生理鹽水對照組，鎖陽含藥血清低、中、高劑量組。

1.2 藥物及其制備

本實驗所用中藥鎖陽購自同仁堂大藥房。根據預實驗，本實驗藥物高劑量組濃度設置為0.9 g．mL-1。稱取90 g鎖陽，煎至100 mL，使其最終藥物濃度為0.9 g．mL-1，此為高劑量組藥物濃度，采取倍比稀釋法分別稀釋適量為0.45、0.225 g．mL-1，分別為中劑量組與低劑量組灌胃濃度。

1.3 主要試劑與儀器

CCK8試劑盒(北京全式金生物技術有限公司，批號：#L21114)，堿性磷酸酶(ALP)染色試劑盒(南京建成科技有限公司，批號：20180124)，0.2%茜素紅染色試劑盒(北京Solarbio公司，批號：20171127)，倒置相差顯微鏡(日本 Olympus,型號：CK40-F200)，細胞計數儀(上海睿鈺生物科技有限公司，型號：IC1000)，二氧化碳培養箱(日本SANYO，型號：MCO-15AC)，全波長酶標儀(美國Thermo公司，型號：Varioskan),超凈工作臺(蘇州凈化廠，型號：SWCJ-2F)。

1.4 方法

1.4.1 含藥血清制備 根據每只小鼠體重分別灌胃各組小鼠相應濃度的鎖陽水煎液(0.1 mL/10 g)，每天一次，連續灌胃兩周(14天)，并于最后一次灌胃2h后摘眼球取血，靜置半小時，3500 rpm．min-1離心15min后立即于超凈工作臺中操作，將同組血清混合，過0.22 μm濾膜除菌后于56℃恒溫水浴鍋中補體滅活30 min，將每組血清各自分裝為1mL/支，-20℃冰箱中保存備用。

1.4.2 成骨細胞來源與培養…成骨細胞株MC3T3-E1Subclone 14來源于小鼠顱頂前成骨細胞亞克隆14，細胞培養基為含10%胎牛血清，1%雙抗的α-MEM培養基。細胞長滿至瓶底80%時，棄去舊培養基，PBS沖洗后用胰酶消化至變圓時，立刻加入等量培養基終止消化，并根據細胞情況按合適的傳代比例進行傳代。

1.4.3 實驗分組 將成骨細胞分為四組，分別為生理鹽水血清組，鎖陽含藥血清低劑量組，含藥血清中劑量組及含藥血清高劑量組，每組的培養基中分別含有10%對應組血清，不含胎牛血清，生理鹽水血清組培養基為含10%灌胃生理鹽水小鼠的血清。

1.4.4 成骨細胞增殖檢測…取生長情況良好的第三代成骨細胞，以2×103個/100 μL每孔的細胞密度接種于96孔板，每組平行設置6個復孔，24h后換為分別含10%濃度的鎖陽含藥血清低、中、高劑量的培養液繼續培養成骨細胞，對照組則換為含10%生理鹽水組血清的培養液。分別繼續培養24、48、72 h后棄去舊培養液，每孔加100 μL不含血清的α-MEM培養基、10 μLCCK8試劑， 37℃、含5%的CO2培養箱培養繼續培養4 h，于酶標儀450 nm處檢測其OD值。

1.4.5 成骨細胞堿性磷酸酶活性檢測…取對數生長期的成骨細胞以5×103 個/100 μL/孔的細胞密度接種于12孔板中，每組平行設置3個復孔，24 h后將培養液換為不同濃度的鎖陽含藥血清培養基進行培養，對照組加等量生理鹽水組血清，期間每隔兩天換液一次，培養七天后進行鈣鈷法染色，并于倒置顯微鏡下觀察染色結果，測定其成骨細胞的ALP活性。

1.4.6 成骨細胞礦化結節染色…取長勢良好的成骨細胞用胰酶消化后，以5×103 個/500 μL/孔的細胞密度鋪12板，每組平行設置三復孔，24 h后更換終濃度為含10 mM的β-甘油磷酸鈉與50 mg．L-1抗壞血酸的誘導培養基進行培養，以后每隔2～3天換液一次，換液時動作要輕柔，避免細胞脫離瓶底。連續培養14天后進行茜素紅染色，觀察染色結果。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析，實驗數據計算采用均數±標準差(x±s)表示，采用單因素方差分析法(ANOVA)，組間比較采用t檢驗，以p＜0.01為差異有顯著性意義。

2 結果

2.1 成骨細胞增殖情況(CCK8法)

在24，48，72 h三個時間點，鎖陽含藥血清各組增殖均高于生理鹽水血清組，差異具有統計學意義(P＜ 0.05)。其中鎖陽含藥血清中劑量組與高劑量組在三個時間點的增殖程度與生理鹽水血清組相比，差異均具有顯著性意義(P ＜ 0.01)；而鎖陽含藥血清低劑量組在48 h，72 h兩個時間點與生理鹽水血清組比較，差異不具有顯著性意義。(P ＞0.01) (Fig.1)

Fig.1鎖陽含藥血清對MC3T3-E1成骨細胞增殖的影響(x±s,n=6)

2.2 成骨細胞ALP活性檢測(鈣鈷法)

鈣鈷法染色后，胞質中陽性反應呈現灰黑色顆粒或塊狀、條狀沉淀。如圖示，成骨細胞分泌ALP的含量隨著鎖陽含藥血清濃度增加呈現遞增趨勢，而生理鹽水血清組分泌的ALP明顯少于藥物血清組。(圖2)

圖2 不同濃度鎖陽含藥血清對MC3T3-E1細胞堿性磷酸酶染色結果(10×20)

2.3 成骨細胞茜素紅染色

經0.2%茜素紅染液染色后，鈣沉積物呈橙紅色。如圖示，鎖陽含藥血清高劑量組的鈣化結節較其他兩組更多，分布更加廣泛。而生理鹽水血清組的鈣化結節顏色較淺，數量最少。(圖3)

圖3 不同濃度鎖陽含藥血清對MC3T3-E1細胞茜素紅染色(10×20)

3 討論

鎖陽是一味傳統補腎中藥，具有補腎陽，益精血的作用。祖國醫學認為，腎主骨生髓，故認為補腎類中藥與骨的形成發育或骨類疾病有密切的關系。張霞等[4]發現，鎖陽80%乙醇提取物可以對去卵巢致大鼠的骨質疏松產生明顯的預防作用；史平等[5]發現，40 mg．kg-1的鎖陽多糖可逆轉血清BGP及尿液DPD含量，其類雌激素樣作用使其具有防治骨質疏松的作用；馮方[6]用鎖陽提取液干預激素性股骨頭壞死兔模型8周后，發現其能促進股骨頭壞死情況的好轉；本實驗通過鎖陽含藥血清干預成骨細胞，旨在從成骨細胞角度觀察鎖陽與骨形成發育的相關性。

MC3T3-E1是來源于小鼠顱頂的成骨細胞株，其與體內成骨活性很相似，在抗壞血酸和3-4mM無機磷酸鹽中生長表現出高水平的細胞分化，是研究成骨細胞很好的細胞模型[7～8]。本實驗采用操作更簡便，更精確的CCK8法[9]檢測MC3T3-E1細胞增殖，發現在24，48，72 h三個時間點，與生理鹽水血清組比較，鎖陽含藥血清組能夠不同程度的促進MC3T3-E1的增殖，且有一定的濃度依賴性，鎖陽含藥血清濃度越高，細胞增殖越多。

成骨細胞富含堿性磷酸酶(ALP)，其是主要分布于細胞膜的鈣結合轉運蛋白，具有促進細胞成熟、鈣化的作用，其活性可作為評價成骨細胞分化程度的良好指標[10]。成骨細胞有體外礦化特征，礦化結節形成是成骨細胞骨形成功能的表現[11]。本實驗結果表明，不同濃度的鎖陽含藥血清能夠不同程度的促進體外成骨細胞增殖分化以及礦化，且在一定濃度范圍內，濃度越高，促進作用越明顯，提示鎖陽可能通過促進成骨細胞增殖分化與鈣化干預骨形成。

補腎中藥主要通過BMP-Smads、Wnt/β-catenin等信號通路促進成骨細胞的作用，進而促進骨形成過程[12]。Zhang JF等[13]發現，淫羊藿可通過BMP和Wnt /β-連環蛋白信號傳導途徑對成骨分化起促進作用，Tang DZ等[14]證明補骨脂素可上調BMP2和BMP4基因表達量，增加BMP報告基因12xSBE-OC-Luc的活性，同時增強了BMP信號傳導的直接靶基因Osx的表達，進而促進成骨細胞分化。本實驗初步觀察得到鎖陽含藥血清可以促進成骨細胞增殖分化，具體經由BMP信號通路還是Wnt/β-catenin等其他信號通路途徑發揮作用，還需進一步研究。