翠云草總黃酮對肺癌細胞生長的抑制作用

舒姮，毛知娟，楊勇，周燕，葉卉

翠云草（Selaginella uncinata (Desv.) spring）是卷柏科卷柏屬植物，又名藍地柏、綠絨草、金雞鳳尾草，主要在我國廣東、廣西、云南、貴州等南方地區分布。翠云草為民間習用藥，植物全草均可藥用，具有清熱解毒、消瘀、止血、利濕等功效[1～2]。研究發現翠云草中的黃酮類物質豐富，主要含有穗花杉雙黃酮、羅波斯塔雙黃酮、羅波斯塔-4＇-甲醚和2″，3″-二氫-4-甲氨基穗花杉雙黃酮等[3]。有研究發現翠云草的總黃酮（total flavones of Selaginella uncinata（Desv.）spring，TFS ）具有抑制結腸癌細胞的作用[4]。但翠云草的黃酮類物質對肺癌細胞的生長是否具有抑制效應未見報道。本研究通過TFS作用于肺癌A549細胞和H460細胞，觀察其對肺癌細胞生長的影響和作用機理，為翠云草抗腫瘤活性的深入研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

翠云草購于四川省荷花池中藥材市場；A549細胞、H460細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）、DMEM高糖培養基（GIBCO公司）、胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）、CCK8試劑盒與細胞周期檢測試劑盒、ECL化學發光試劑（碧云天生物技術有限公司）；兔源ERK抗體、兔源

p-ERK抗體、兔源GAPDH抗體、羊抗兔多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；無水乙醇等分析純試劑（成都科龍化工試劑）。酶標儀（FC，Thermo），流式細胞儀（CytoFLEX，Beckman），蛋白檢測成像系統（Chemi Doc，BIO-RAD）。

1.2 方法

1.2.1 翠云草總黃酮制備…取翠云草藥材1000 g，粉碎成粗粉后過 60 目篩，用60%乙醇加熱提取 20 min，提取 2 次，合并濾液，減壓旋轉蒸發后烘干至恒重， AB - 8 大孔吸附樹脂純化，70% 乙醇洗脫、富集，濃縮干燥得到翠云草提取物。以蘆丁為對照品，提取物用甲醇溶解，酶標儀下進行掃描；提取物在 510 nm 有最大吸收峰，吸收光譜與蘆丁相似，故翠云草提取物含有黃酮類物質。以蘆丁作為標準品測定吸光度值繪制標準曲線， 根據回歸方程計算出翠云草總黃酮的含量為 2.68 mg．g-1。翠云草總黃酮以DMSO溶解，配制成濃度為 1 mg．mL-1的溶液 4℃保存備用。

1.2.2 細胞培養及檢測…A549細胞和H460細胞用DMEM高糖培養基（含10%胎牛血清，青霉素100 IU．mL-1，鏈霉素IU．mL-1）于37 ℃、5% CO2常規培養。（1）細胞增殖檢測：取處于對數生長期的細胞以每孔5千個的密度接種到96孔培養板中，24 h后加入終濃度為5～40 μg．mL-1的TFS，每個濃度6個重復孔，同時設置DMSO對照組；于加藥后的24、48、72 h加入CCK8試劑，酶標儀450 nm處下測定吸光度值并計算生長抑制率。抑制率=（OD對照組-OD藥物組）/OD對照組×100%。（2）細胞周期檢測：取處于對數生長期的細胞以每孔10萬個的密度接種到6孔培養板中，24 h后加入終濃度為10、20 μg．mL-1的TFS；加藥24 h后消化離心收集細胞，根據細胞周期檢測試劑盒的操作流程操作并于細胞流式儀檢測分析細胞周期。（3）ERK蛋白和p-ERK蛋白檢測：取處于對數生長期的細胞以每孔10萬個的密度接種到6孔培養板中，24 h后加入終濃度為10 μg．mL-1和20 μg．mL-1的TFS；加藥24 h后收集細胞，采用RAPI裂解液提取蛋白總蛋白，SDS-PAGE電泳，對蛋白進行電轉移（200 mA，50 min）并切割目的條帶，目的條帶分別用ERK抗體、p-ERK抗體、GAPDH抗體4℃孵育過夜，羊抗兔多克隆抗體室溫孵育2 h，加入ECL化學發光試劑后于蛋白檢測成像系統檢測目的蛋白。

1.2.3 數據統計分析…以三次重復實驗的數據采用SPSS軟件進行方差分析，以雙尾α=0.05的水準進行差異顯著性檢驗。

2 結果

2.1 細胞增殖檢測

TFS作用于肺癌A549細胞和H460細胞后，細胞的生長均受到抑制，抑制的效果隨著TFS濃度的增加和作用時間的增長而增強。見圖1。

圖1 TFS對A549細胞和H460細胞生長的影響

2.2 細胞周期檢測

TFS作用于肺癌A549細胞后，使細胞阻滯于G0/G1期；與對照組相比，兩個TFS組的周期分布差異顯著（P＜0.05）。作用于H460細胞后，使細胞阻滯于S期和G2/GM期；與對照組相比，兩個TFS組的周期分布差異顯著（P＜0.05）。與對照組相比，兩種細胞中，DMSO對細胞的周期分布均無明顯改變（P＞0.05）。在兩種細胞中，TFS的劑量為10 μg．mL-1時與20 μg．mL-1時的細胞周期分布差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖2和圖3。

圖2 TFS對A549細胞周期的影響

圖3 TFS對H460細胞周期的影響

2.3 ERK蛋白和p-ERK蛋白檢測

TFS作用于肺癌A549細胞和H460細胞后，降低了p-ERK的表達水平；此外，TFS還降低了H460細胞中ERK總蛋白的表達（P＜0.05），但對A549細胞中ERK總蛋白的表達影響不顯著（P＞0.05）。在兩種細胞中，TFS的劑量為10 μg．mL-1時與20 μg．mL-1時對總ERK蛋白和p-ERK蛋白的改變無顯著差異（P＞0.05）。

圖4 TFS對ERK蛋白表達的影響

3 討論

惡性腫瘤在我國是致死性位居第二的疾病，其中肺癌的發病率和死亡率也在逐漸增加，已成為我國發病率最高的惡性腫瘤，每年約有700萬人診斷為肺癌，600萬人死于肺癌[5]。化學藥物治療是肺癌的主要治療手段之一，但目前已在臨床治療中的藥物在治療過程中會出現藥物耐受而降低治療效果；開發新的藥物是解決該問題的方法之一。我國藥物資源豐富，從中草藥中挖掘開發治療腫瘤的藥物不僅有助于腫瘤的臨床治療，也有助于夯實中藥在現代臨床治療中的作用。

翠云草為卷柏科卷柏屬植物，在南方廣泛分布，具有清熱解毒、利濕通絡、化痰止咳、止血生肌等功效，內服和外用均可，在一些少數民族地區也有用于治療腫瘤的臨床應用。翠云草的主要活性物質為黃酮類化合物[6～8]，但對其黃酮類物質抗腫瘤活性的研究報道極少，僅有孫楨楨等人[4]的研究發現翠云草的總黃酮可能通過降低結腸癌HT-29細胞中環氧化酶COX-2的mRNA和蛋白的表達而發揮其抗腫瘤的效應。而明確翠云草黃酮類物質抗腫瘤的機制有助于翠云草活性物質在臨床中的開發利用。

惡性腫瘤細胞最基本的生物學特征是失控性增殖；細胞失控性增殖的生物學基礎是細胞周期調控紊亂，這種紊亂通常與腫瘤細胞內的重要信號通路調控失常有關；在多種腫瘤細胞中均發現有調控細胞生長增殖的信號異常活化。作為絲裂原活化蛋白激（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的主要信號通路之一的 Ras/Raf/MEK/ERK信號通路是調控細胞生長、分化、凋亡等的主要信號通路之一，胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）是該通路中的末端信號傳遞者，被上游的MEK磷酸化而激活后調節其他激酶或轉錄因子的活化進而調節多種基因的表達。研究發現ERK的高表達在非小細胞肺癌的發生、發展中起了重要的促進作用[9]；ERK通路在肺腺癌形成早期階段已被激活，使癌細胞的增殖、侵襲、遷移等能力增強[10]；在肺癌患者的癌細胞中p-ERK的陽性表達率可高達70%[11～12]；抑制ERK通路的活性可能抑制腫瘤細胞生長，ERK信號通路已成為腫瘤治療的重要靶點。

本研究發現，翠云草總黃酮對肺癌A549細胞和H460細胞的生長具有抑制作用，對兩種細胞的周期進程均具有干擾，使A549細胞阻滯于G0/G1期和H460細胞阻滯于S期和G2/GM期；細胞周期進程的變緩或停滯則使細胞的生長增殖變緩。此外，翠云草總黃酮使A549細胞中ERK的活化水平降低，即p-ERK的表達降低；而使H460細胞中ERK總蛋白的表達和其活化水平均降低。以上結果表明，翠云草總黃酮對肺癌A549細胞和H460細胞的生長具有抑制作用，使細胞的周期進程停滯變緩，這種抑制作用可能與其降低ERK 信號通路的活性有關。而何種因子參與了該信號的上游調控以及何種下游基因發揮了抑癌效應則需要進一步的研究驗證。本研究提示翠云草具有抑制肺癌細胞生長的潛能。