續隨子ElPDAT1基因生物信息學及表達特性分析

任國鵬，葛麗萍，孫超超，唐 露

（山西農業大學林學院，山西 太谷 030801）

續隨子（Euphorbia lathyris L.）屬于大戟科大戟屬1～2年生草本植物[1]，原產于歐洲[2]，引入我國栽培已久。續隨子在我國主要被用作藥用植物[3]，作為油料作物卻不多見[4]。CALVIN 等[5]研究發現，續隨子種子油脂與理想柴油替代品的分子組成類似，可以代替石油作為新能源，是一種具有開發前景的新型能源油料作物，因此，其也被稱為“石油植物”[6]。近年來，中國農科院油料作物研究所、中科院植物研究所等科研部門分別進行了續隨子種質資源的收集、核型分析、新品種選育及生物柴油制備的研究[7-9]。另外，續隨子種子中油脂含量很高，總油脂含量約45%～60%[10]。危文亮等[11]通過對不同的續隨子品種的研究發現，續隨子種子中油的脂肪酸成分以 C16和 C18脂肪酸為主，主要為棕櫚酸（16∶0）、油酸（18∶1）、亞油酸（18∶2）、亞麻酸（18∶3），該 4 種脂肪酸占總脂肪酸含量的96%以上，且在不同試驗材料中的油酸占總脂肪酸含量的比例均超過83%。因此，了解續隨子在我國作為能源植物發展的潛力，分析其種子的油脂合成過程以及研究調控該油脂合成過程中相關基因具有重要的意義。

油料植物通常在種子中會積累大量的三酰甘油（TAG），這些油脂既是工業用油和食用油的主要來源，也是種子生長發育所必須的能量來源[12]。TAG是油脂的主要儲存形式，在內質網上[13]經過多種酶催化甘油和脂肪酸而形成[14]。經二酰甘油?；D移酶（DGAT）催化二酰甘油而形成三酰甘油的過程被稱為Kennedy 途徑[15]，這是TAG 合成的主要途徑。除此之外，TAG 合成還存在著另一條途徑，不依賴于脂酰-CoA 的合成途徑（即PDAT 途徑）。在PDAT 酶的催化下，磷脂酰膽堿（PC）sn-2 位的酰基鏈能夠轉移到二酰甘油上，最終形成TAG 和溶血卵磷脂（LPC）[16-17]。這2 條途徑是植物種子油脂累積的重要途徑，所以，PDAT 在TAG 合成過程中也起著重要的調控作用。PDAT 途徑最早在釀酒酵母中發現，且證明PDAT 基因促進了酵母中TAG 的合成[18]。當酵母DGAT 基因發生突變時，該酵母TAG含量與野生型相比降低了50%，而DGAT 和PDAT雙突變的酵母中TAG 的含量僅為野生型的1%[19]。以酵母PDAT 基因為探針在擬南芥中獲得2 個PDAT 基因，并通過研究證實了該基因在油脂合成中的重要作用[20]。目前，對于續隨子ElPDAT1 基因的功能和表達特性的相關研究還未見報道。

本研究以續隨子為試材，對PDAT1 基因進行了生物信息學分析，并通過qRT-PCR 分析該基因的表達特性，旨在了解PDAT1 基因在續隨子種子油脂合成中的調控機制，為進一步分析該基因的生物學功能及其他油料作物的油脂改良與利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用的續隨子材料栽培于山西農業大學林學院苗圃，所用種子采自榆次栽培植株。分別采集續隨子根、莖、葉、花及種子發育的3 個時期S1（花后 15 d），S2（花后 30 d），S3（花后 45 d）的種子保存于-80 ℃冰箱，用于RNA 的提取。

1.2 ElPDAT1蛋白的鑒定

以擬南芥的AtPDAT1 蛋白為檢索序列，對續隨子的轉錄組數據進行BLAST 比對，分析獲得ElPDAT1 蛋白，并從轉錄組數據庫中篩選出功能注釋為PDAT1 的基因，最終得到續隨子ElPDAT1 基因cDNA 全長序列。

1.3 續隨子ElPDAT1基因的序列特征及蛋白功能分析

續隨子ElPDAT1 蛋白的分子量、脂質系數、平均親水性指數等理化性質通過在線軟件ProParam（https://web.expasy.org/protparam/）進行分析；采用軟件 TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和 SignalP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對續隨子ElPDAT1 的跨膜結構域及信號肽進行預測；利用NCBI-CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預測續隨子ElPDAT1 蛋白的功能結構域；通過在線軟件SOPMA（https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和 SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）對續隨子ElPDAT1 蛋白進行二級結構及三級結構的預測和建模；運用MEGA 7.0 多序列比對軟件對續隨子和已知功能的植物種類的PDAT1 蛋白序列構建系統進化樹。

1.4 續隨子ElPDAT1基因的表達特性分析

根據分析獲得的續隨子ElPDAT1 基因的cDNA 序列，用在線軟件Primer 5 設計實時熒光定量PCR 的引物。以ElActin[21]基因作為內參，進行PCR擴增。引物序列如表1所示。

表1 ElActin 和ElPDAT1 基因的熒光定量PCR 引物序列

利用全式金TRNzol RNA 提取試劑提取續隨子的根、莖、葉、花及種子不同發育時期的RNA。采用abm 公司的 5×All-In-One MasterMix（with AccuRT Genomic DNA Removal Kit）反轉錄試劑盒反轉錄獲得cDNA。實時熒光定量PCR 通過CFX96TMOptics Module（BIO-RAD）qRT-PCR 分析儀進行擴增。使用SYBR/FAM only 作為熒光染料，用abm 公司的EvaGreen2×qPCR 試劑盒，以續隨子ElActin 作為內參基因，進行實時熒光定量PCR 檢測。每個樣品分別進行3 次生物學重復和3 次技術重復。反應體系（10 μL） 為：EvaGreen2×qPCR MasterMix 5 μL，Forward Primer 0.3 μL，Reverse Primer 0.3 μL，Template DNA 0.5 μL，Nuclease-free H2O 3.9 μL。實時熒光定量 PCR 反應程序為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循環數為 40 個。

1.5 數據分析

試驗采用Excel 和SPSS 軟件處理數據，并繪制表達量柱狀圖。

2 結果與分析

2.1 續隨子ElPDAT1基因的序列特征分析

續隨子ElPDAT1 基因的cDNA 全長2 968 bp，編碼區長度2 037 bp，共編碼678 個氨基酸（圖1）。對PDAT1 蛋白理化性質分析（表2）表明，該蛋白相對分子質量為75.38 ku，為不穩定親水性蛋白。

表2 續隨子ElPDAT1 蛋白理化性質分析

使用TMHMM 在線軟件預測蛋白質跨膜區和跨膜方向（圖2），續隨子ElPDAT1 蛋白存在一個典型的跨膜螺旋區，由膜內到膜外，位于53～75 區域，跨膜現象明顯。

利用Signal P 4.1 軟件對續隨子ElPDAT1 蛋白信號肽預測結果（圖3）表明，該蛋白不存在信號肽及切割位點。

通過NCBI-CDD 對續隨子ElPDAT1 蛋白進行功能結構域預測，結果表明，續隨子ElPDAT1 基因所編碼的蛋白質屬于PLN02517 superfamily，含有典型的 PLN02517 保守結構域（圖4）。PLN02517 為磷脂酰膽堿酰基轉移酶超家族，因此，可以預測ElPDAT1 蛋白具有酰基轉移功能，該結果與其他已知的物種PDAT1 蛋白預測的功能一致。

利用在線軟件SOPMA 預測續隨子ElPDAT1蛋白二級結構，結果表明，ElPDAT1 蛋白的二級結構主要由4 種元件組成：無規則卷曲（43.95%）、α-螺旋（34.81%）、延伸鏈（14.60%）、β-轉角（6.64%）。其中，無規則卷曲和α-螺旋是該蛋白的主要元件。利用SWISS-MODEL 在線軟件對續隨子ElPDAT1蛋白三級結構預測（圖5），與二級結構預測結果一致。

2.2 續隨子ElPDAT1蛋白的系統進化樹分析

利用MEGA 7.0 多序列比對軟件對續隨子及蓖麻（Ricinus communis）、橡膠樹（Hevea brasiliensis）、麻瘋樹（Jatropha curcas）、木薯（Manihot esculenta）、陸地棉（Gossypium hirsutum）、花生（Arachis hypogaea）、大豆（Glycine max）等同源性較高物種的PDAT1 蛋白的氨基酸序列進行比對分析，并構建系統進化樹。結果發現，續隨子與蓖麻、木薯、麻瘋樹的親緣關系較近（圖6），而它們均屬于大戟科，并且它們之間的序列相似度高達84%以上，與陸地棉、大豆等不同科植物的親緣關系較遠。

2.3 續隨子ElPDAT1基因在不同器官中的表達特性分析

為了研究ElPDAT1 基因在續隨子不同器官及種子發育不同時期的表達量與種子含油量的關系，本研究選取續隨子根、莖、葉、花及種子發育的3 個時期S1，S2，S3，對ElPDAT1 基因的表達特性進行分析。結果顯示，ElPDAT1 基因在續隨子根、莖、葉、花及種子的不同發育時期均有表達，在根和莖中表達量最低，但在種子中的表達量明顯高于其他器官。在種子的不同時期，表達量先升高后降低，在種子的S2 時期表達量最高。以葉的表達量作為對照，S2 時期的表達量為葉的5.82 倍（圖7）。

3 結論與討論

植物種子中的油脂主要以TAG 的形式存在，TAG 是通過復雜的生理生化過程在植物體中進行合成和積累。DGAT 是Kennedy 途徑中的限速酶和關鍵酶，對種子的油脂合成起到重要調控作用[22-23]。但是在TAG 不依賴于酰基-CoA 的合成途徑中，PDAT 則被認為是TAG 合成的關鍵酶。因此，為了更好地理解ElPDAT1 在續隨子油脂合成中的調控作用，本研究對獲得的續隨子ElPDAT1 基因進行了詳細的生物信息學分析，結果顯示，ElPDAT1 基因的cDNA 序列全長為2 968 bp，共編碼678 個氨基酸；理化性質預測結果均符合PDAT1 基因的特征，屬于不穩定的親水性蛋白；結構域預測表明，ElPDAT1 蛋白含有PLN02517 保守結構域，并具有PDAT 酶活性。不同物種間進化樹分析發現，ElPDAT1 蛋白與蓖麻、木薯、麻瘋樹的親緣關系較近，它們的同源性最高達到84%，這與植物分類學中將它們歸為一個科的結果一致。

在植物種子中，油脂主要是以TAG 的形式而儲存，相對于Kennedy 途徑，PDAT 途徑的研究相對較少，但有研究表明，將外源PDAT1 基因轉入酵母突變體中，使該突變體的TAG 合成能力得到恢復[24-25]。擬南芥中采用RNA 干擾擬南芥AtPDAT1 后，種子中油脂含量減少了70%～80%，且花粉管不能正常萌發，胚發育受阻[26]。其他研究發現，當DGAT1 基因缺失后，擬南芥種子中經過PDAT1 途徑合成和積累的TAG 含量高達野生型的70%，且該基因催化產生大量不飽和脂肪酸[27]?？梢?，PDAT 基因對TAG的合成及植物的生長發育有著不可或缺的作用。因此，為更多地了解續隨子中ElPDAT1 介導的TAG合成途徑，本試驗研究了ElPDAT1 基因在續隨子不同器官及種子不同時期的表達量，結果表明，ElPDAT1 基因在續隨子的各個器官中均有表達，在根和莖的表達量非常低，但在種子中的表達量比其他器官高出很多。在種子發育初期即S1 時期表達量較高，在發育中期即S2 時期達到最高，而后降低。這與之前對續隨子中油脂成分積累規律的研究結果相符，證明ElPDAT1 基因在續隨子種子TAG的合成過程中起到關鍵的作用。

續隨子是重要的油料植物，其油脂含量很高，因此，圍繞續隨子油脂合成關鍵基因展開研究，是研究續隨子的主要途徑之一。ElPDAT1 作為續隨子種子油脂合成的另一條途徑的關鍵基因，本研究通過生物信息學及qPCR 表達模式分析，證明了該基因與續隨子種子油脂合成的關系，為闡明ElPDAT1基因的功能和續隨子及其他油料作物油脂改良提供了依據。