黃瓜蠟質合成基因CsCER10的表達模式及生物學信息分析

王世峰，郭 燁，李梅蘭，侯雷平，王文嬌

（1.山西農業(yè)大學園藝學院，山西 太谷 030801；2.山西省蔬菜產業(yè)管理站，山西 太原 030000）

植物表皮蠟質是覆蓋在陸生植物表皮的一種保護層[1]。它在保護植物抵御紫外線灼傷、病蟲侵害、水分散失[2-3]等方面發(fā)揮著重要作用。大量研究表明，植物蠟質層的化學成分非常復雜，在不同植物、組織器官和生長階段中的形態(tài)結構、含量和組成不同[4-6]。

目前關于擬南芥蠟質合成途徑研究的比較透徹，分為3 個階段：在質體中合成C16 和C18 脂肪酸并轉移到內質網上，作為參與超長鏈脂肪酸的合成底物；在內質網中，C16 和C18 脂肪酸延長為超長鏈脂肪酸，其中大部分用于形成表皮蠟；在內質網中，長鏈脂肪酸由2 種途徑（合成醛、烷、仲醇以及酮類的烷類合成途徑；合成伯醇和酯類的伯醇合成途徑[7-11]）被修飾成各種主要的蠟質成分。

在擬南芥中，AtCER10 起著編碼烯酰輔酶A 還原酶的作用，在各個組織部位均有表達，并且在超長鏈脂肪酸的合成中也起重要作用[12]。cer10 突變體中的蠟質含量下降到野生型的40%，并且在UV-B輻射下，蠟質總量及桿狀晶體結構明顯減少，莖稈表面出現(xiàn)無規(guī)則片狀、膜狀結構[13-14]。

前人通過熒光定量在黃瓜中已經篩選出可能與蠟質合成及運輸相關的候選基因：CsCER1，CsWAX2，CsCER4，CsCER6，CsCER8 和 CsCER10，并且已經研究鑒定了CsCER1 和CsWAX2 在黃瓜蠟質合成中的功能，而CsCER10 目前尚未被研究[15-16]。

本試驗主要研究CsCER10 在黃瓜中的表達模式及生物學信息，旨在為蠟質形成的分子機制提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗選用的黃瓜品種為中國農業(yè)大學的3407。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料種植 先將黃瓜種子置于55 ℃水中消毒15 min，然后在室溫下靜置4 h，之后將種子鋪在帶有濕潤紗布的培養(yǎng)皿中，并在28 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2 d。將發(fā)芽的種子播種在配好的營養(yǎng)土中，并將培養(yǎng)箱條件設定為：光周期16 h 光照、8 h 黑暗，晝夜溫度分別為 25，18 ℃[17]。

1.2.2 試驗設計 選取生長至三葉一心的黃瓜幼苗進行鹽脅迫、干旱及低溫處理。在鹽脅迫處理中，分別用不同濃度的 NaCl 溶液（0（CK），50，100，150 mmol/L）灌溉幼苗7 d[18]。在干旱處理中，在10%的 PEG-6000 中，將幼苗分別浸泡 0（CK），1，2，3 h[19]。低溫處理為 12 ℃低溫中分別放置 0（CK），24，48 h。在每個處理后，將葉片取下，用液氮迅速冷凍并儲存于 -80 ℃中（3 次重復），用于提取 RNA[20]。在同一天采集根、莖、莖表皮、葉片、雄花、雌花以及花后7 d 的果實和果皮，樣品取下后用液氮迅速冷卻，存儲于-80 ℃中，用于提取RNA。

1.2.3 RNA 提取及cDNA 反轉錄 RNA 提取使用TIANGEN 公司的RNA 提取試劑盒，使用TaKaRa 公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒將 RNA 反轉錄成 cDNA[21]。

1.2.4 熒光定量PCR 選擇TUA 為內參基因，以cDNA 為模板，用購于TaKaRa 的熒光定量試劑盒在型號為7500 RT-PCR 機器上進行試驗，相對表達量根據(jù) 2-ΔΔCt計算獲得[22]。PCR 體系設定為：95 ℃預變性 30 min；95 ℃變性 30 s，52 ℃退火 30 s，40 個循環(huán)。CsCER10 引物為 5′-GGCAAAGGCTAACTCT TCCCG-3′和 5′-CCTTGAAGACAACGGTTATGCTG-3′。TUA 引物為 5′-ACGCTGTTGGTGGTGGTAC-3′和 5′-GAGAGGGGTAAACAGTGAATC-3′。

1.2.5 序列比對與進化樹分析 使用NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中的 BLAST 分析功能，輸入CsCER10 序列會得到不同物種的氨基酸序列。運用DNAMAN 將得到的相關氨基酸序列進行比對；系統(tǒng)進化樹運用MEGA5 軟件中的鄰位相連法構建。

1.2.6 理化性質分析 本研究采用ExPASy 中的ProtParam 功能分析CsCER10蛋白質序列的理化性質。

1.2.7 蛋白質三維結構預測 同源建模法是基于序列同源比對的一種蛋白質三維結構預測方法，是目前比較有效且最常用的方法。本研究將CsCER10蛋白序列在SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）中構建模型，下載 PDB 格式，導入SPDBV 軟件進行空間結構分析。

1.2.8 跨膜區(qū)預測 CsCER10蛋白的跨膜區(qū)是使用 TMHMM server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）進行預測的。

2 結果與分析

2.1 CsCER10在黃瓜中的表達模式

通過熒光定量PCR 技術對CsCER10 在黃瓜不同組織部位中表達模式的研究結果顯示，CsCER10在所采集的各個組織部位中均有表達，且在葉、雌花及果皮中表達量較高（圖1），在果皮中的表達水平是果實中的14 倍。

2.2 不同非生物脅迫對CsCER10表達的影響

野生型黃瓜幼苗在不同非生物脅迫處理下qRT-PCR 結果顯示，CsCER10 的表達水平在干旱、鹽脅迫及低溫脅迫下均呈上升趨勢，其中，鹽脅迫處理尤為明顯。從圖2可以看出，隨著NaCl處理濃度的增加，CsCER10 的表達量升高，在100，150 mmol/L 處理下的表達量分別為對照的7 倍與26 倍。干旱處理的結果顯示，隨著處理時間的增加，CsCER10 的表達量上升，當處理達到3 h 時，CsCER10 的表達量達到了對照的8 倍（圖3）。低溫處理結果顯示，低溫處理時間與CsCER10 的表達量成正比，處理48 h 時CsCER10 的表達量是對照的19 倍（圖4）。

2.3 CsCER10蛋白序列比對及進化樹分析

為了進一步分析CsCER10與其他物種的同源關系，將其與擬南芥、苦瓜、蘋果和蘆筍的序列進行比對，一致性在81.61%～93.55%（圖5）。

構建了系統(tǒng)進化樹進一步分析CsCER10 與其他同源蛋白之間的進化關系。此進化樹包含12 個物種，有擬南芥、苦瓜、蘆筍等。其中，CsCER10與AtCER10 處于同一進化支上，此結果說明，CsCER10 屬于與蠟質合成的CER 家族（圖6）。

2.4 蛋白質理化性質分析

CsCER10蛋白的cDNA 全長為933 bp，包含有1 個開放閱讀框，編碼了310 個氨基酸。相對分子質量為78 827.12，等電點PI 為5.09，分子式為C2888H4845N933O1224S206，不穩(wěn)定系數(shù)為51.76，屬于不穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為25.29，總親水性為0.704，為水溶性蛋白。其氨基酸組成如表1所示，丙氨酸與蘇氨酸的含量較高。

表1 CsCER10 蛋白序列氨基酸組成 %

2.5 蛋白質三維結構預測

蛋白質三維結構分析結果（圖7）顯示，CsCER10蛋白具有16 個 α 螺旋，4 個 β 折疊。

2.6 跨膜區(qū)預測分析

從圖8可以看出，預測的跨膜螺旋數(shù)為3，膜內螺旋氨基數(shù)為68.688 8，而膜內螺旋數(shù)大于18 時表明該蛋白有跨膜區(qū)域，故CsCER10蛋白有跨膜區(qū)域，在前60 個氨基酸中有39.887 5 個膜內螺旋氨基數(shù)，表明CsCER10 編碼的蛋白質可能是一個信號肽。

3 討論

3.1 CsCER10可能參與黃瓜表皮細胞發(fā)育

本研究在不同組織中的熒光定量結果表明，CsCER10 在黃瓜表皮細胞的發(fā)育中起著重要作用。

3.2 CsCER10受非生物脅迫誘導

本試驗中非生物脅迫處理后熒光定量PCR 結果顯示，CsCER10 基因在遭受干旱、鹽脅迫及低溫時表達量均呈上升的趨勢。有研究表明，水稻中與蠟質合成相關的基因OsGL1，在干旱和低溫處理中表達量均上升[23]。王文嬌等[15-16]研究表明，參與蠟質合成的CsCER1 和CsWAX2 均可以被NaCl、低溫及干旱等非生物脅迫誘導且表達水平均呈上升趨勢。因此，CsCER10 與 CsCER1 和 CsWAX2 一樣，能夠受非生物脅迫的誘導。

3.3 CsCER10可能參與黃瓜蠟質合成

在擬南芥中，AtCER10 是一種烯酰輔酶A 還原酶（ECR），這是超長鏈脂肪酸合成中的關鍵因素。本研究中，CsCER10 與AtCER10 蛋白處于同一進化支上，說明CsCER10 屬于蠟質合成的CER 家族，且可能在超長鏈脂肪酸的合成中起著重要的作用。熒光定量結果顯示，CsCER10 在葉片和果表皮中的表達量比較高，且其在果皮中的表達量是果實中的14 倍。劉小鳳等[24]研究結果表明，與蠟質合成相關的CsCER7 在黃瓜各個組織部位均有表達，且果表皮的表達量高于果實，這與CsCER10 的研究結果一致。前人研究表明，蠟質合成部位在植物的表皮細胞[25]，因此，推斷CsCER10 可能與黃瓜蠟質合成相關。

4 結論

本試驗綜合研究了CsCER10 在黃瓜不同組織中的表達模式，并且對其生物學信息進行分析。結果表明，CsCER10 受非生物脅迫誘導，其表達量在黃瓜葉片和果皮中較高，并且CsCER10蛋白與AtCER10 蛋白處于同一進化支上，因此，推斷CsCER10 可能參與蠟質的合成，但其具體的分子機制需進一步研究與驗證。