激素組合等在甘藍型油菜下胚軸再生中的作用

耿思宇，張姍姍，徐培林，王景雪

（1.山西大學生命科學學院，山西 太原 030006；2.中山大學教育部基因工程重點實驗室，廣東 廣州 510275）

油菜是我國重要的油料作物，其外植體高效再生系統的建立對于油菜的遺傳改良、基因功能研究等都具有重要的意義。以往的研究認為，基因型、激素等對外植體的高效再生都具有重要作用。油菜不同品種在外植體再生能力方面存在著明顯的基因型依賴性，且多數品種的分化能力并不理想。因此，在油菜基因轉化中，針對不同材料優化培養基，建立高效外植體再生系統是進行高效轉化的前提。

油菜中外植體的植株再生一般是通過器官發生的方式實現的。在蕓苔屬中已有用不同外植體如下胚軸[1]、子葉[2]、花莖[3]、葉片[4]、表皮及亞表皮細胞的薄細胞層[5]、根系[6]、花藥、小孢子[7-8]、原生質體[9-10]等獲得再生植株的報道。植物組織培養涉及因素較多，并且各因素間具有復雜的相互作用，因此，經驗的積累尤為重要。前人雖然已對影響植株再生的諸多因素如培養基、基因型[11-13]、不同外植體之間的差異以及所使用植物激素的數量[14]等進行了研究，但是所用的植物激素僅限于少數幾種，并且多數是根據所用材料選擇高效的植物激素組合，對于不同激素組合的比較研究較少。

對于一個高效的再生體系而言，除了選擇最適宜的培養基和外植體外，還必須保證用于組織培養的供試材料處于良好的生理條件。一般來說，來源于溫室生長的植株以及在無菌條件下生長的無菌苗是較好的外植體來源。OVESNA 等[15]研究表明，供體植株的年齡也會影響外植體的再生能力。對不同遺傳背景材料的植株再生能力的研究表明，不同的遺傳背景對植株的再生能力具有一定的影響，Brassica oleracea 基因組最容易再生，而Brassica rapa最難轉化[16]。

本試驗利用3 種不同的油菜基因型材料，對6-BA，NAA，GA3等植物激素以及 AgNO3在下胚軸植株再生中的作用進行研究，以明確不同激素種類在外植體再生中的作用，并根據所選用材料對不同培養基進行了優化，選出了最佳的培養基，進而建立甘藍型油菜的高效外植體下胚軸高效再生體系。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試油菜品種為甘藍型油菜（Brassica napus L.）湘油 14 號、湘油 15 號和 Y03-211，其種子由湖南農業大學油料研究所提供。

供試培養基分為2 種，即誘導油菜再生植株分化培養基（主要成分列于表1）和誘導生根培養基（以附加和不附加植物激素，組成4 種不同的誘導生根培養基，即：RM1.1/2 MS；RM2.MS＋0.2 mg/L NAA；RM3.MS＋0.1 mg/L NAA；RM4.MS＋0.2 mg/L IAA）。

1.2 試驗方法

油菜種子用 0.1%（m/V）HgCl2消毒 8 min，無菌水沖洗 5～6 次，置于 MS 固體培養基上，23～25 ℃，16 h/8 h（白天/黑夜）光照條件下發芽，制備成無菌苗。將5～6 d 苗齡的無菌苗下胚軸切成約0.5～1.0 cm 的切段，將下胚軸切段分別置于表1所列的培養基上，以誘導外植體在切口處形成愈傷組織和分化再生芽苗。下胚軸切段接種后，觀察不同培養基上外植體開始形成愈傷組織的時間、外植體的出愈率、外植體分化芽苗總數以及外植體上分化正常苗數。試驗設3 次重復，每個處理接種的外植體數不小于30 個。

表1 誘導油菜再生植株分化培養基主要成分

2 結果與分析

2.1 激素對再生芽苗誘導的影響

下胚軸外植體接種到各種培養基上后，經1～2 d，大多數外植體在切口處開始膨大；到3～4 d 時，切口處開始出現愈傷組織；到7 d 時，外植體切口處愈傷組織誘導基本完成。愈傷組織開始出現時是松散狀的，以后逐漸長成致密狀。從表2可以看出，在供試的培養基中，所有材料都能獲得80%以上的出愈率。說明這些培養基均可以高效地誘導愈傷組織。

表2 不同基因型、不同激素組合的出愈率 %

大約在外植體接種20 d 后，在致密型愈傷組織上先出現綠色小芽點，繼而發育成小芽苗。從表3可以看出，培養基中植物激素對外植體再生芽苗的分化有重要影響。其中，6-BA 對油菜再生植株分化是必需的，3 個品種在無6-BA 的MN 培養基中，雖然都得到了90%以上的出愈率，但均未獲得再生苗，說明6-BA 是油菜下胚軸芽苗再生所必需的。對不同激素組合的研究發現，不同基因型對激素組合的要求不同，多數情況下6-BA 與GA3的組合優于6-BA 和NAA 的組合。就3 個基因型平均分化率而言，MBG 培養基的平均分化率（11.56%）大于MBN 培養基（5.81%）；MB3G 培養基的平均分化率（9.58%）大于MB3N 培養基（1.14%）。

表3 不同基因型、不同激素組合的分化率 %

不同基因型最適合的激素組合不盡相同，如湘油15 號、Y03-211 最適合的培養基為MBG，而湘油14 號最適合的培養基組合為MBN。試驗發現，在培養基中添加GA3，雖然能夠提高再生植株分化率，但是也顯著提高了再生植株中玻璃苗的比例。如湘油15 號在MB3A 培養基上，總分化率為26.00%，其中，正常苗分化率為22.29%；而在MB3AG 培養基上，總分化率為56.51%，其中，正常苗分化率為37.94%。即添加GA3后，總分化率增加30.51%，但是正常苗分化率卻僅增加了15.65%。

2.2 AgNO3在芽苗分化中的作用

表4 AgNO3對不同基因型、不同激素組合分化率的影響 %

從表4可以看出，幾乎在所有的培養基中添加AgNO3都能夠顯著提高正常芽苗分化率。其中，最為明顯的是湘油15 號，其在MBG 培養基上正常芽苗分化率為11.83%，而在MBGA 培養基上正常芽苗分化率為38.29%，較MBG 培養基提高了26.46 百分點；湘油14 號在MB3G 培養基上正常芽苗分化率為7.95%，而在MB3GA 培養基上正常芽苗分化率則為32.05%，較MB3G 培養基提高了24.10 百分點。

通過對16 種含有6-BA 培養基上的不同品種正常芽苗分化率比較發現，供試培養基中，MBGA（MS＋2 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L GA3＋20 μmol/L Ag-NO3）培養基最有利于誘導再生植株分化，3 個供試品種的最高正常芽苗分化率（湘油15 號為38.29%；Y03-211 為20.00%；湘油14 號為32.63%）均是在該培養基上得到的（圖1）。因此，將MBGA 培養基作為農桿菌轉化后再生植株誘導培養基。3 個供試品種下胚軸外植體在MBGA 培養基上再生植株分化情況如圖2所示。

2.3 基因型對芽苗分化的影響

從表2，3 可以看出，不同品種再生植株分化能力不同。在培養基成分相同時，3 個供試品種中具有不同的芽苗分化率，說明基因型對芽苗分化具有重要影響。整體來說，湘油14 號再生能力較強，Y03-211 號次之，湘油15 較差。湘油14 號對培養基的適應性要比湘油15 號強一些，但是試驗中觀察到湘油14 號在供試培養基上再生苗的玻璃化比湘油15 號嚴重。本試驗中還發現，除了培養基成分對玻璃苗的發生有較大影響外，不同品種在是否容易產生玻璃苗上也表現不同。3 個品種中，玻璃苗發生最多的是湘油14 號。分化出的玻璃苗表現為葉片水漬狀，葉色是不正常的綠色，葉片發脆易斷，不能誘導生根。所以，玻璃苗是無效的分化苗，在組織培養過程中應該盡量減少其生成。

2.4 生根培養基的選擇

油菜芽苗再生后，要經過誘導生根才能成為完整的再生植株。因此，生根培養基的誘導效果直接影響轉化后抗性芽苗發育成完整的再生植株的概率。一個高效率的生根培養基對提高轉化效果十分重要。大約3 cm 長的油菜芽苗移入生根培養基后，10 d 后開始有白色的根狀突起出現，之后根狀突起發育為不定根；經過30 d 左右的生長，發育為生長良好的根系。

從表5可以看出，油菜生根使用植物生長素NAA 誘導比使用IAA 誘導或不使用植物激素誘導生根效果要好；不同培養基生根率不同，在4 種培養基中，誘導油菜生根效果最好的培養基是MS＋0.2 mg/L NAA，生根率可以達到90%。

表5 不同生根培養基比較

3 結論與討論

本試驗通過不同激素組合培養基的篩選發現，基因型、激素組合以及培養基中AgNO3的添加對再生植株的分化都具有重要影響。培養基中6-BA 對油菜芽苗分化是必要的，當培養基中缺少6-BA時，3 個品種均無芽苗分化。而NAA 對于愈傷組織的形成和芽苗生根非常重要，培養基中增加NAA時，下胚軸的出愈率明顯增加，這與前人的研究結果相同[17-18]。已往的研究表明，AgNO3對于包括油菜在內的蕓薹屬作物的再生植株分化具有顯著的促進作用[19-22]。一般認為，AgNO3對芽分化的促進作用是AgNO3抑制了植物組織培養中乙烯的生成。本試驗中，AgNO3對于所選用的材料再生植株的高頻率分化具有明顯的促進作用；NAA 對誘導愈傷組織和芽苗生根具有重要作用。

油菜的芽苗分化是通過器官分化的途徑發生的。本研究表明，細胞分裂素6-BA 對誘導外植體的芽苗分化是必需的，6-BA 與GA3的組合優于6-BA與NAA 的組合。在本試驗所選用的油菜材料和培養基組成中，MBGA（MS＋2 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L GA3＋20 μmol/L AgNO3）培養基最有利于誘導再生植株分化；RM2（MS＋0.2 mg/L NAA）培養基最有利于誘導再生芽苗生根。本研究利用不同的油菜材料建立并完善了高效的外植體再生系統，為建立農桿菌介導的油菜高效遺傳轉化體系奠定了一定的基礎。