Myf5在不同生長階段小鼠心肌中的定位與表達

李經緯，薛霖莉，2，曹 靖，冀云燕，李藝雷，任華偉，羅小毛，于秀菊，赫曉燕，王海東

（1.山西農業大學動物科技學院，山西 太谷 030801；2.山西農業大學信息學院，山西 太谷 030800；3.北京農業職業學院畜牧獸醫系，北京 102442）

近年來，有關心血管疾病的患病率呈現逐年升高的趨勢，并且心血管疾病給患者的身心健康和生活質量帶來了嚴重的不良影響[1]。例如，心功能不全、心肌鈣化、心肌肥厚、先天性心臟病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的發生均與心臟相關轉錄因子的突變和功能失調有著十分緊密的關系[2]。研究調控心臟相關轉錄因子的表達機制是細胞分子生物學研究中的熱點，有利于對心血管疾病的發生、發展及預后有更加精確的判斷。

調節因子 MRFs（Myogenic Regulatory Factors）家族可編碼多種不同的轉錄因子，包括MyoD（Myf3），Myogenin（MyoG），Myf5 和 Myf6（MRF4），它們是控制肌細胞增殖和分化的關鍵調節因子，跟肌纖維的數量、大小有著密切的關系[3]。在結構上，調節因子MRFs 家族均含有一段大小為80 個氨基酸的高度保守的中央蛋白基序（motif）形成的堿性螺旋-環-螺旋（bHLH）的結構域，該結構包含的Basic 結構和HLH 螺旋結構分別是與DNA 相互作用的區域和與其他因子相互作用的位點也是調控的重要功能結構區域[4]。調節因子MRFs 家族成員能夠通過對不同E-Box 識別和結合，從而選擇性的對肌肉特異性基因進行選擇性的表達調控[5]。在動物體發育的不同階段，MRFs 中的相關轉錄因子在肌肉發育過程中相互協同作用，對肌組織發育發揮著不同的表達調控作用，NAIDU 等[6]研究表明，Myf5在上游能夠調控肌細胞開始向成肌纖維分化。

目前，通過建立斑馬魚模型已經發現一些與心臟的特化與分化、心臟祖細胞的遷移、心血管的形成以及心臟功能的一些基本的調節因子和調控機制[7]。YANG 等[8]通過敲除斑馬魚 Myf5，結果發現，斑馬魚的斜紋肌、外直肌、胸骨肌、舌骨肌和所有咽喉部的相關肌肉的發育受到了明顯的抑制。隨著特定基因敲除技術的提高和組織誘導表達工具盒的廣泛運用，在已有的模式組織中用已經了解存在的基礎科研知識篩選心臟發育疾病的候選基因相當熱門。RUDNICKI 等[9]研究發現，將小鼠的Myf5 和MyoD 基因都敲除后，缺失Myf5 和MyoD 的小鼠肌纖維和成肌細胞生成受到了顯著抑制。敲除MyoD的小鼠在胚胎發育過程中基本上和正常小鼠一致[10]，但是Myf5 的表達量在祖細胞中大幅提高，并且試驗組小鼠四肢的發育顯著延遲[11]。RUDNICKI 等[12]在試驗中通過敲除小鼠Myf5 發現，雖然小鼠四肢發育正常，但是小鼠的MyoD 的表達明顯延遲，而且小鼠的肌節發育也明顯變緩。

有關Myf5 的研究主要集中在骨骼肌發育方面的表達調控，但對Myf5 在心肌發育過程中表達調控作用的研究甚少。

本試驗通過對幼年、性成熟、體成熟和老年4 個不同發育階段的小鼠心肌組織采用HE 染色法、免疫組織化學法和實時熒光定量PCR 技術，對Myf5 在小鼠心肌表達情況進行定性和定量分析，初步探討Myf5 在正常小鼠心肌不同發育階段的表達情況，為進一步揭示Myf5 在心臟發育的病理狀況差異性和調控機制提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 隨機選取健康的幼年（1 周齡）、性成熟（3-4 周齡）、體成熟（8 周齡）和老年（12 周齡）發育階段的小鼠各4 只，試驗小鼠均由山西農業大學動物醫學國家級實驗室教學示范中心提供。

1.1.2 試劑 Trizol、反轉錄試劑盒、qRT-PCR 試劑盒，均購自TaKaRa 公司；免疫組化試劑盒，購自北京康為世紀生物科技有限公司；Myf5 兔多克隆抗體，購自武漢三鷹公司；Myf5 上下游引物，購自北京六合華大基因科技有限公司。

1.2 石蠟切片制作

選取健康的幼年、性成熟、體成熟和老年發育階段的小鼠各4 只，采用斷頸法處死小鼠，取其心肌組織，之后將心肌組織進行橫切，并用Bouins 固定液固定。之后經過脫水、透明、浸蠟、包埋4 步處理后使用切片機切成6 μm 厚的切片。

1.3 HE和免疫組織化學染色

1.3.1 小鼠心肌組織HE 染色 將心肌組織切片經二甲苯和不同梯度濃度酒精脫蠟、復水后，依次用蘇木精和伊紅染色，之后進行脫水、透明、中性樹膠封片，并于顯微鏡下觀察。

1.3.2 小鼠心肌組織免疫組織化學 切片脫蠟、復水后，用PBS 緩沖液進行沖洗，擦凈，枸櫞酸鹽微波抗原修復30 min，冷卻后滴加內源性過氧化物酶封閉液（solution A），之后室溫孵育10 min，并用PBS緩沖液沖洗后滴加羊血清工作液（solution B），室溫孵育20 min 并滴加一抗（1∶30 稀釋），陰性對照滴加PBS 代替一抗，將切片置于4 ℃冰箱過夜；次日，室溫孵育30 min 后用PBS 緩沖液沖洗并滴加生物素標記羊抗兔二抗工作液（solution C），之后37 ℃孵育30 min 并用PBS 緩沖液沖洗；然后滴加HRP 標記的鏈霉親和素（solution D）后在37 ℃孵育30 min，依次在切片組織上滴加30 μL 的DAB 顯色劑并用PBS 緩沖溶液進行沖洗，經蘇木精復染、脫水、透明，最后用中性樹膠進行封片、顯微鏡下觀察。

1.4 引物設計

根據NCBI 檢索小鼠的Myf5 基因序列，使用Premier 5.0 軟件設計熒光定量PCR 擴增引物，并對引物的特異性進行初步檢測，引物由北京華大公司合成。引物序列和產物長度列于表1。

表1 引物序列和產物長度

1.5 RNA提取和qRT-PCR

Trizol 法提取幼年、性成熟、體成熟、老年4 個年齡階段小鼠的心肌組織總RNA 并測定濃度，之后反轉錄并使用熒光定量試劑盒進行熒光定量PCR，反應條件為：95 ℃預變性 10 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 10 s，30～35 個循環。內參條件同上進行擴增，每個樣本至少3 個重復，反應完成后，運用 2-ΔΔCT法計算 Myf5 在幼年、性成熟、體成熟、老年4 個年齡階段小鼠心肌組織的相對表達水平。

2 結果與分析

2.1 不同發育階段小鼠心肌形態學特征分析

不同發育階段的小鼠心肌組織HE 染色結果顯示，隨著小鼠的發育成熟，肌纖維的橫切面逐漸增大，細胞核逐漸變大，中心化現象減少。細胞核和肌纖維面積的比值也呈現漸變性的縮小，發育到老年階段比值達到最小。同時，組織間隙也越來越變寬，特別是在體成熟階段組織之間的間隙明顯增多，到達老年階段組織間隙達到最大（圖1）。

2.2 不同發育階段小鼠心肌Myf5蛋白表達情況分析

不同發育階段小鼠心肌組織的免疫組化結果顯示，Myf5 在4 個不同發育階段的小鼠心肌組織細胞中均有表達，表達部位為細胞核。而且在幼年階段小鼠心肌組織胞核著色程度最深，其次是老年的小鼠心肌組織，在性成熟和體成熟小鼠心肌組織中表達最低，說明Myf5 在幼年階段小鼠心肌組織的表達量最高，其他發育階段的表達量較低（圖2）。

2.3 Myf5基因PCR擴增結果分析

經過PCR 篩選發現，條帶3 沒有出現非特異性的條帶和拖尾現象，而且產量高，片段大小符合設計，得出最適合的退火溫度為60 ℃（圖3）。

2.4 不同發育階段小鼠心肌Myf5 mRNA表達差異分析

根據 Myf5 擴增曲線（圖4）可以發現，Myf5 基因擴增曲線和內參擴增曲線均呈現“S”型曲線，有平穩的平臺期。將實時熒光定量PCR 檢測出的Myf5 在不同發育階段小鼠心肌組織表達量的數據進行處理，得出Myf5 基因在不同發育階段小鼠心肌組織的相對表達量有顯著性差異（圖5），即隨著小鼠的發育成熟，Myf5 在不同發育階段心肌組織中的表達呈現先降低后升高趨勢，與性成熟、體成熟階段相比，幼年心肌組織的表達量呈現差異極顯著（P＜0.01），與老年階段差異不顯著（P＞0.05）。Myf5 從幼年開始到老年、體成熟、性成熟階段表達依次降低，性成熟階段達到最低。

3 討論

Myf5 是調節因子MRFs 家族的重要成員，在不同的時空通過對肌細胞的增殖和分化進行調控，并與成肌纖維的數量以及肌衛星細胞修復再生有著緊密的聯系。CASES 等[13]在研究中發現，Myf5 是調節因子MRFs 家族中最早開始被誘導表達，即在小鼠的胚胎發育過程就已經開始了表達。調節因子MRFs 家族的各個成員之間在表達調控上有著緊密的相互聯系，因此，Myf5 對MRFs 家族其他成員的表達起到了關鍵性的誘導作用。LUDOLPH 等[14]在對Myf5 在非洲爪蟾的胚胎發育過程中作用的研究時發現，Myf5 過表達會激活非肌細胞系，從而使得生肌節代償性增大。并且RUDNICKI 等[12]在試驗中通過敲除小鼠Myf5 發現，雖然小鼠四肢發育正常，但是小鼠的MyoD 的表達明顯延遲，而且小鼠的肌節發育也明顯變緩。敲除MyoD 的小鼠在胚胎發育過程中基本上和正常小鼠一致[10]，但是Myf5 的表達量在祖細胞中大幅提高，并且MyoD 敲除組小鼠四肢的發育顯著延遲[11]。RUDNICKI 等[9]通過試驗研究發現，將小鼠的Myf5 和MyoD 基因都敲除后，缺失Myf5 和MyoD 的小鼠肌纖維和成肌細胞生成受到了顯著抑制。這些試驗都說明，Myf5 在肌組織的表達起著重要調控作用，并且KNOLL 等[15]證實了Myf5 在小鼠的成肌細胞和肌衛星細胞的增殖與分化的過程中均起著重要調控作用。本試驗發現，隨著小鼠的發育成熟，Myf5 在心肌組織的表達呈現出一定關聯性。MONTARRAS 等[16]研究表明，Myf5 主要與成肌細胞的特化與增殖有關，而Myf5 對肌細胞的分化具有更重要作用。Myf5 在功能上與成肌細胞數目有著緊密的聯系，并且在小鼠出生時心臟組織基本發育完全。隨著小鼠的發育成熟，Myf5 在心肌組織的表達會呈現降低的趨勢，這與本試驗的結果基本吻合。

吳瓊彪等[17]通過對烏珠穆沁羊生長不同發育階段中骨骼肌MRFs 家族基因在組織的特異性表達的研究發現，MRFs 家族基因相對表達量為6月齡＞12月齡＞18月齡，6月齡的基因表達量最高，與其他月齡之間相比有顯著差異，與本研究結果一致。黎威等[18]研究發現，馬身豬和大白豬背最長肌中Myf5 mRNA 相對表達量均為初生時最高，30日齡次之，之后逐漸降低。陳禧等[19-20]對Myf5 基因在第10，14，18，22，27 天的鴨胚和出生后 1 周雛鴨的小腸平滑肌的相對表達量研究發現，Myf5 基因在不同的發育階段中表達呈現先增高后降低的變化趨勢，第10 天表達量最高。綜上所述，從出生后隨著動物的發育成熟，Myf5 無論在平滑肌組織、骨骼肌組織還是心肌組織中的表達均呈現降低的變化趨勢。

SANTERRE 等[21]通過基因轉染的方法成功的將小鼠Myf5 基因轉染進牛的基因組后，發現被轉染的牛能夠表達小鼠的Myf5 基因并且產生了異位性的肌肉。而且LINDON 等[22]對Myf5 在成肌細胞表達調控的研究發現，Myf5 在不同的時空中有著不同的表達模式。總之，Myf5 基因表達與心肌正常發育調控有著明顯的相關性，但是在患有心臟疾病的病理情況下，Myf5 表達變化的研究還不夠充分，依然需要對Myf5 在心臟發育的病理狀況差異性表達和調控機制做進一步的研究。

4 結論

本研究結果表明，在小鼠心肌組織發育的不同階段中，Myf5 表達在幼年鼠最高，性成熟鼠最低，其呈現先降低后緩慢上升的趨勢，并且幼年階段與其他的不同發育階段呈現極顯著性差異，表明Myf5 表達與小鼠心肌組織發育具有相關性。