應用gpt delta轉基因小鼠模型評價電子煙氣溶膠的遺傳毒性

管 瑩 ，許 亮 ，尤馨悅 ，高 茜 ，唐偉鋒 ，4，米其利 ，曹易懿 ，朱洲海 ，奚 晶 ，劉維映，欒 洋，夭建華*

1.云南中煙工業有限責任公司技術中心 云南省煙草化學重點實驗室，昆明市北市區紅錦路181號 650231

2.上海交通大學醫學院虹橋國際醫學研究院/公共衛生學院，上海市黃浦區重慶南路280號 200025

3.上海艾博思生物科技有限公司，上海市浦東新區紫薇路750弄12號 201203

4.上海大學環境與化學工程學院環境污染與健康研究所，上海市寶山區上大路99號 200444

電子煙又稱電子煙堿遞送系統，是目前國際市場上具有代表性的新型煙草制品之一。近年來，電子煙作為一種“戒煙產品”或“吸煙替代品”在國外市場的銷量快速增加［1］。電子煙氣溶膠的毒理學特性已成為新型煙草制品相關研究的熱點之一。有研究表明，電子煙氣溶膠的毒性顯著低于傳統卷煙煙氣［2-5］，但是有關電子煙安全性、有效性的評估尚沒有足夠的臨床研究數據。2013年7月9日，世界衛生組織發表的聲明中稱“電子煙堿遞送系統的安全性尚未得到科學論證，其對使用者健康帶來的可能風險還沒有定論”［6］。鑒于目前關于電子煙的臨床前毒理學評價研究較少，因此建立電子煙的體外、體內毒理學測試方法，并進行相關的健康風險評估研究就顯得迫切。

與遺傳毒性的體外評價方法相比，體內實驗方法的假陽性發生率較低，因此其應用日益受到重視。gtp delta 轉基因小鼠模型是Nohmi 等于1996年建立的一種利用6-巰基鳥嘌呤進行陽性篩選的新型的體內基因突變檢測模型［7］。與Muta 和 Big Blue 小鼠 相比 ，gtp delta 轉 基 因 小 鼠模型有如下優點：實驗操作簡單，突變容易鑒定；gpt 基因的長度為456 bp，有利于進行DNA 序列和突變機制分析；自發突變率低，可以檢測點突變、移碼突變、堿基置換等堿基突變，也可以檢測大范圍（1～10 kb）的缺失。本課題組應用gpt delta轉基因小鼠進行了大量的環境化合物的遺傳毒性評價和機制研究［8-9］。在本研究中，利用gpt delta轉基因小鼠模型，通過檢測靶器官基因突變頻率和特征、外周血微核試驗、Pig-a 基因突變試驗和實時熒光定量PCR 分子生物學方法對電子煙進行毒理學評價，旨在建立電子煙安全性評價的動物模型評價方法，為電子煙的研發提供安全性技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 受試物

電子煙（18 mg 煙堿，市售）；肯塔基3R4F 參比卷煙（煙堿量0.73 mg/支，美國肯塔基大學）。

1.1.2 實驗動物及分組

gpt delta 轉基因雄性小鼠，由上海交通大學醫學院實驗動物科學部提供。采用SM450 型20 孔道直線型吸煙機（英國Cerulean 公司）產生煙氣，煙氣直接接入煙氣吸入染毒儀（天津合普公司）進行小鼠全身暴露，暴露的實驗環境條件符合GB 14925—2010［10］中對動物實驗設施的有關要求，溫度為（22±2）℃，含氧量在19%～22%范圍內。3R4F參比卷煙采用ISO 抽吸模式抽吸，電子煙采用加拿大深度抽吸（HCI）模式抽吸。

動物分組如下：空白對照組、溶媒對照組、3R4F 參比卷煙高劑量組、3R4F 參比卷煙低劑量組、電子煙組高劑量組和電子煙組低劑量組，各組對應的小鼠數量分別為 4、4、6、6、6、6 只。其中，3R4F 參比卷煙低、高劑量暴露組分別為2 和6 支/d；電子煙（煙堿量約30 μg/口）低、高劑量暴露組分別為50 和150 口/d。溶媒對照組為丙二醇和丙三醇的混合液，抽吸電子煙口數與電子煙高劑量抽吸口數一致。每天暴露1 次，每周暴露5 d，連續暴露4 周。其中，3R4F 參比卷煙組和電子煙組的低、高劑量組分別為暴露40 和80 min/d。

1.1.3 試劑和儀器

FITC-anti-mouse CD24 抗體 、APC anti-mouse TER-119 抗體、PE Rat anti-mouse CD71、BD Accuri C6 流式細胞儀（美國 BD 公司）；miR qRT-PCR Quantitation Kit（上海艾博思生物公司）；RecoverEase（tm） DNA Isolation Kit、MX3000P 熒光定量PCR儀（美國 Stratagene公司）；GentraR PuregeneR Blood Kit（美國 Qiagen 司）；DNA 引物［生工生物工程（上海）股份有限公司］。

1.2 方法

1.2.1 外周血網織紅細胞微核試驗

采用本實驗室建立的吖啶橙染色法［11］（Acridine Orange，AO）進行試驗。

血液標本制作：采集血液時，輕拭除去AO 涂層載玻片表面的灰塵，取5 mL 外周血滴在預制好的載玻片中央，立即蓋上蓋玻片，室溫下靜置2～3 h后計數。細胞染色后使用熒光顯微鏡在40 倍物鏡下觀察有網狀結構的網織紅細胞，至少計數2 000個網織紅細胞，以判斷網織紅細胞的微核率。

1.2.2 外周血紅細胞Pig-a 基因突變試驗

Pig-a 基因突變頻率測定［12］：取 1μL 的 EDTA-2K 抗凝血劑、2 μL 的 FITC-anti-mouse CD24 抗體、5 μ L 的 APC anti-mouse TER-119 抗體 、200 μ L Dulbecco's PBS 緩沖液，混合后在室溫避光孵育1 h。樣本在室溫下避光孵育1 h 后，1 600 g 條件下離心5 min 去除上清液。加入0.5 mL Dulbecco's PBS，輕輕吹打均勻細胞懸液，放置于冰上，待用流式細胞儀檢測。

網織紅細胞百分比（RET%）測定：采用PE Rat anti-mouse CD71 抗體，同時設定陰性對照以及CD24、TER-119 和 CD71 單陽性對照，方法同上。

1.2.3 實時熒光定量PCR 檢測mRNA 表達水平

取小鼠肺臟約20 mg，置于RNAlater 中保存。按照trizol 操作說明［13］提取肺總RNA，隨后在溶解的RNA 中加入DNaseI 并于37℃水浴中孵育30 min，進行苯酚/氯仿抽提和乙醇重新沉淀，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性和基因組DNA 的去除情況。實時熒光定量PCR 按照試劑盒說明進行操作，利用Primer Premier 5.0 軟件設計如下引物：

Gapdh：上游引物5'-AGGTCGGTGTGAACGG ATTTG-3'，下游引物5'-TGTAGACCATGTAGTTG AGGTCA-3'；Il-6：上游引物5'-TAGTCCTTCCTA CCCCAATTTCC-3'，下游引物5'-TTGGTCCTTAG CCACTCCTTC-3'；Tnf-a：上游引物 5'-TCTACTG AACTTCGGGGTGATCG-3'，下游引物5'-AGATG ATCTGAGTGTGAGGGTCTGG-3'；Akt1：上游引物5'-ATGAACGACGTAGCCATTGTG-3'，下游引物5'-TTGTAGCCAATAAAGGTGCCAT-3'。

1.3 數據統計學處理

采用SPSS17.0 進行數據的統計學處理與分析。數據以表示，采用方差分析進行多組間比較，采用卡方檢驗進行差異比較，以α=0.05 為檢驗標準。

2 結果與討論

2.1 電子煙對染色體損傷作用

細胞有絲分裂后期形成的微核與染色體損傷有關，通過計算微核率可以判斷受試物引起的染色體損傷的情況［14］。各劑量組gpt delta 轉基因小鼠外周血網織紅細胞微核率見表1。由表1 可以看出，電子煙和3R4F 參比卷煙各劑量組小鼠的微核率與空白對照組相比，差異均無統計學意義（P＞0.05），表明電子煙和3R4F 參比卷煙未導致小鼠染色體損傷。

表1 電子煙氣溶膠和3R4F 參比卷煙煙氣對外周血網織紅細胞微核形成的影響（）Tab.1 Effects of e-cigarette aerosol and 3R4F reference cigarette smoke on formation of peripheral blood reticulocyte micronuclei（）

表1 電子煙氣溶膠和3R4F 參比卷煙煙氣對外周血網織紅細胞微核形成的影響（）Tab.1 Effects of e-cigarette aerosol and 3R4F reference cigarette smoke on formation of peripheral blood reticulocyte micronuclei（）

組別空白對照組溶媒對照組3R4F參比卷煙低劑量組3R4F參比卷煙高劑量組電子煙低劑量組電子煙高劑量組動物數量/只4 4 6 6 6 6微核率/%0.52 ± 0.11 0.49 ± 0.05 0.46 ± 0.08 0.48 ± 0.13 0.49 ± 0.06 0.51 ± 0.09

2.2 電子煙致突變作用

細胞表面存在許多分化抗原，這些抗原通過糖基磷脂酰肌醇聚糖（GPI）錨連接在細胞表面，Pig-a 基因是位于x 染色體上的與GPI 錨合成相關的基因［15］。Pig-a 基因單次突變即可導致該細胞GPI 錨缺陷和表面相應抗原缺失。當致突變物質作用于基因組時，重要基因（如癌基因/抑癌基因）和Pig-a 基因均會被誘發突變，因此可以通過檢測細胞表型（相應表面抗原是否缺失）來考察發生基因突變的細胞比例，進而計算基因突變頻率，評價受試物的致突變性［16］。

各劑量組對gpt delta 轉基因小鼠外周血網織紅細胞致突變作用結果見表2。可以看出，與空白對照組相比，電子煙和3R4F 參比卷煙組Pig-a 基因突變頻率和RET%無統計學差異，表明電子煙和3R4F 參比卷煙無誘發gpt delta 轉基因小鼠外周血紅細胞Pig-a 基因突變頻率升高的作用，且未對造血功能產生影響。

2.3 電子煙對與DNA損傷和炎癥相關的基因表達的影響

選擇 mmu-miR-34a、mmu-let-7a、Akt1、Il-6 和Tnf-a 進行轉錄水平的表達檢測，mmu-miR-34a 和mmu-let-7a 是遺傳學損傷相關性非編碼RNA，與DNA 損失與細胞增殖、凋亡等有關［17-18］，而 Akt1、Il-6 和Tnf-a 在炎癥及反應及其信號通路調控中發揮重要作用［19］。電子煙對兩種基因表達影響結果見圖1～圖5。

表2 電子煙氣溶膠和3R4F 參比卷煙煙氣對外周血網織紅細胞的致突變作用（）Tab.2 Effects of e-cigarette aerosol and 3R4F reference cigarette smoke on mutagenicity of peripheral blood reticulocytes（）

表2 電子煙氣溶膠和3R4F 參比卷煙煙氣對外周血網織紅細胞的致突變作用（）Tab.2 Effects of e-cigarette aerosol and 3R4F reference cigarette smoke on mutagenicity of peripheral blood reticulocytes（）

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與空白對照組和溶媒對照組相比，電子煙低劑量組和高劑量組mmu-miR-34a 表達顯著降低（P＜0.05）；電子煙高劑量組mmu-let-7a 表達略微升高（P＜0.05）；電子煙低劑量組和高劑量組Akt1 mRNA 表達水平無顯著性變化（P＞0.05）；電子煙低劑量組和高劑量組Il-6 表達降低（P＜0.05）；電子煙低劑量組和高劑量組Tnf-a 表達顯著降低（P＜0.05），可能是電子煙抑制了 mmu-miR-34a、Il-6 和Tnf-a 基因的轉錄水平的表達，并對mmu-let-7a 表達有一定的促進作用，其后續的生物學意義還需進一步研究。

圖1 電子煙氣溶膠和3R4F 參比卷煙煙氣對mmu-miR-34a 表達水平的影響Fig.1 Effects of e-cigarette aerosol and 3R4F reference cigarette smoke on mmu-miR-34a microRNA expression

圖2 電子煙氣溶膠和3R4F 參比卷煙煙氣對mmu-let-7a 表達水平的影響Fig.2 Effects of e-cigarette aerosol and 3R4F reference cigarette smoke on mmu-let-7a microRNA expression

圖3 電子煙氣溶膠和3R4F 參比卷煙煙氣對Akt1 mRNA 表達水平的影響Fig.3 Effects of e-cigarette aerosol and 3R4F reference cigarette smoke on Akt1 mRNA expression

圖5 電子煙氣溶膠和3R4F 參比卷煙煙氣對Tnf-a mRNA 表達水平的影響Fig.5 Effects of e-cigarette aerosol and 3R4F reference cigarette smoke on Tnf-a mRNA expression

與空白對照組相比，3R4F 參比卷煙高劑量組mmu-miR-34a 表達顯著降低（P＜0.05）；3R4F 參比卷煙高劑量組mmu-let-7a 表達略微降低（P＜0.05）；3R4F 參比卷煙低劑量組和高劑量組Akt1 和Il-6 mRNA 表達水平無顯著性變化（P＞0.05）；3R4F 參比卷煙高劑量組Tnf-a 表達顯著降低（P＜0.05）。與3R4F 參比卷煙相比，只有電子煙低劑量組抑制了mmu-miR-34a、Tnf-a 表達，而且電子煙低劑量組和高劑量組都降低了Il-6 的表達。電子煙高劑量組促進了mmu-let-7a 的表達，而3R4F 參比卷煙高劑量組抑制了mmu-let-7a 的表達，具體的機制還需進一步研究。

3 結論

采用gpt delta 轉基因動物研究了電子煙的遺傳毒性，與空白對照組相比，電子煙對外周血網織紅細胞微核率無影響，表明電子煙并不會導致染色體損傷。電子煙對Pig-a 基因突變頻率和RET%無影響，因此電子煙在gpt delta 轉基因模型中未誘導基因突變頻率的升高。在本試驗體系下，盡管未發現電子煙有致突變作用，但在電子煙對肺組織的影響實驗中，與細胞增殖、凋亡等有關的mmu-miR-34a 基因表達降低而mmu-let-7a 表達升高，而與炎癥有關的因子Il-6 和Tnf-a 的表達顯著降低。總之，在gpt delta 轉基因小鼠動物模型的毒性評價中未能檢出電子煙具有顯著遺傳毒性，但電子煙對DNA 損傷和炎癥相關基因的表達有一定影響。