蘿卜硫素對HER2 CAR-T細胞分化、細胞內因子分泌及抗腫瘤作用的影響

申春一，張 震，田永貴，張 毅

1)鄭州大學第一附屬醫院生物細胞治療中心 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院腫瘤中心 鄭州 450052 3)河南省腫瘤免疫與生物治療重點實驗室 鄭州 450052

基于嵌合抗原受體修飾T細胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)在臨床治療中的安全性及有效性，美國FDA已于2017年批準其上市[1-2]。然而在細胞制備及回輸過程中，大部分CAR-T細胞分化為終末期的效應T細胞(effector T cell，Teff)，在體內難以維持長時間的抗腫瘤效應[3]。與Teff相比，記憶性T細胞具有強大的抗腫瘤能力，且在體內可以長期存活及分化，有較高的臨床應用價值[4]。記憶性T細胞包括中心記憶性T細胞(central memory T cell，Tcm)和效應記憶性T細胞(effector memory T cell，Tem)，其分化受到多種機制的調控，已有研究[5]表明代謝在T細胞分化過程中發揮重要作用。Teff在分化為記憶性T細胞后其代謝方式由糖酵解轉化為脂肪酸氧化和氧化磷酸化，即發生了代謝重編程[6]。有研究[7]報道，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)作為代謝檢查點可使糖酵解水平增加，而mTOR抑制劑雷帕霉素可抑制這一過程并促進T細胞記憶亞群的分化。作者的前期研究[8]結果也表明，抑制糖酵解或增加氧化磷酸化水平，可促進記憶性T細胞的形成。蘿卜硫素(sulforaphane，SFN)是一種主要富集在十字花科植物中的天然營養素[9]，其對代謝有調控作用[10]，可通過影響糖異生過程控制血糖，并在2型糖尿病的治療中顯示出良好效果[11]。有文獻[12]表明SFN可促進脂肪細胞褐化/脂肪酸氧化和葡萄糖有氧氧化。因此，本研究檢測SFN處理后人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)CAR-T細胞糖酵解途徑及脂肪酸氧化過程相關酶mRNA的表達，探討SFN對HER2 CAR-T細胞分化及抗腫瘤效應的影響和可能機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑RPMI 1640培養基購自美國Sigma公司，胎牛血清購自美國Gbico公司，人外周血淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品有限公司，人CD8分選磁珠、人CD3/CD28活化磁珠購自德國美天旎公司，流式抗體購自美國Biolegend公司，Trizol、Primescript RT reagent Kit購自日本TaKaRa公司，SYBR Green qPCR Master Mix購自德國Roche公司，重組人IL-2購自北京雙鷺藥業股份有限公司。

1.2HER2CAR-T細胞的制備及分組參考文獻[13]分離、獲取CD8+T細胞。采用序列合成方法將識別HER2抗原的HER2-scFv連接至CD28和CD3的信號區，再將其亞克隆入慢病毒載體中，測序驗證HER2 CAR載體構建成功后，通過病毒包裝(293T系統)及T細胞感染獲得HER2 CAR-T細胞(效率達到60%以上)。將HER2 CAR-T細胞鋪于24孔板中，每孔1×106個，設置為對照組及SFN組(加15 μmol/L SFN)，處理72 h后進行下列指標的檢測。

1.3兩組HER2CAR-T細胞分化的檢測收集兩組HER2 CAR-T細胞于1.5 mL離心管中，用PBS洗滌，避光加入CD8-APC-Cy7、CD45RO-PE和CCR7-PerCP，4 ℃孵育20 min后上流式細胞儀檢測。CD45RO-CCR7+為Tn細胞，CD45RO+CCR7+為Tcm細胞，CD45RO+CCR7-為Tem細胞，CD45RO-CCR7-為Teff細胞。

1.4兩組HER2CAR-T細胞中細胞內因子的檢測以A549為靶細胞，以HER2 CAR-T細胞為效應細胞，按效靶比為10∶1共孵育，同時加入阻斷劑BFA(1×)。6 h后收集細胞，PBS清洗后避光加入CD8-APC-Cy7，避光4 ℃孵育20 min后固定破膜，再避光加入胞內抗體IFN-γ-PE-Cy7和TNF-α-APC，檢測兩組細胞內IFN-γ及TNF-α的分泌水平。每組設3個復孔。實驗重復3次。

1.5兩組HER2CAR-T細胞殺傷能力的檢測以A549為靶細胞，以HER2 CAR-T細胞為效應細胞，設置效靶比分別為1∶1、5∶1和10∶1，共孵育6 h。采用Annexin V和PI雙染法檢測細胞凋亡情況。細胞凋亡率越高代表HER2 CAR-T細胞的殺傷能力越強。每組設3個復孔。實驗重復3次。

1.6兩組HER2CAR-T細胞中糖酵解途徑及脂肪酸氧化過程相關基因的檢測將HER2 CAR-T細胞離心棄上清，加入1 mL Trizol提取總RNA，反轉錄后行PCR。反應體系(20 μL)：cDNA 2 μL，SYBR GREEN染料10 μL，上、下游引物(1 μmol/L)各4 μL。反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40個循環；72 ℃ 10 min延伸。每組設3個復孔。實驗結果采用2-ΔΔCt法分析。引物及序列見表1。實驗重復3次。

表1 引物序列及產物大小

HK2：己糖激酶2；PFKM和PFKP：磷酸果糖激酶；PKM：丙酮酸激酶；CPT1A：肉毒堿棕櫚酰基轉移酶

1.7統計學處理采用SPSS 17.0進行數據分析，應用兩獨立樣本的t檢驗比較兩組細胞分化、細胞內因子分泌水平、細胞殺傷能力、細胞中糖酵解途徑及脂肪酸氧化過程相關酶mRNA表達的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1兩組HER2CAR-T細胞分化的比較見表2。由表2可知，與對照組相比，SFN處理后Tcm細胞比例升高。

表2 兩組HER2 CAR-T細胞分化的比較(n=3) %

2.2兩組HER2CAR-T中細胞內因子分泌水平的比較見表3。由表3可知，與對照組相比，SFN能促進HER2 CAR-T細胞內因子的分泌。

表3 兩組HER2 CAR-T細胞內因子分泌水平的比較

2.3兩組HER2CAR-T細胞對A549殺傷能力的比較見表4。由表4可知，SFN組A549凋亡率高于對照組。

表4 兩組HER2 CAR-T細胞對A549殺傷能力的比較 %

2.4兩組HER2CAR-T細胞中糖酵解途徑及脂肪酸氧化過程相關酶mRNA的表達結果見表5。由表5可知，經SFN處理后，HER2 CAR-T細胞糖酵解途徑關鍵酶mRNA表達水平較對照組降低，脂肪酸氧化過程相關酶CPT1A mRNA表達水平較對照組升高。

表5 兩組HER2 CAR-T細胞中糖酵解途徑及脂肪酸氧化過程相關酶mRNA的表達(n=3)

3 討論

SFN被看作是已知的所有天然抗癌物質中效果最好的活性成分，在體外和體內實驗中均證實可以誘導多種腫瘤細胞凋亡和細胞周期阻滯[14-15]。作者的前期研究[16]發現SFN可促進CD8+T細胞記憶前體細胞的分化。本研究結果顯示，經SFN處理后HER2 CAR-T細胞記憶性T細胞亞群分化增多，IFN-γ及TNF-α分泌水平和殺傷活性增加，提示采用SFN處理CAR-T細胞有望成為體外擴增記憶性T細胞亞群并增強其功能的一種方法。

在腫瘤微環境中，腫瘤細胞的代謝特征被稱為Warburg效應，即在有氧條件下，腫瘤細胞也主要以無氧糖酵解的方式提供能量[17]。T細胞在靜息狀態下的代謝方式為氧化磷酸化，而經過刺激后其代謝方式轉變為糖酵解[18]。CAR-T細胞也有相似的分化過程與代謝模式，如何通過調節代謝方式獲得記憶性細胞是研究的重點。目前通過調節代謝影響T細胞分化的藥物主要集中在靶向代謝檢查點的激活劑或抑制劑[19-20]。本研究發現，SFN可抑制HER2 CAR-T細胞的糖酵解途徑關鍵酶mRNA的表達，促進記憶亞群的形成。但SFN調控T細胞糖酵解的具體分子機制尚未闡明，有待進一步探究。

目前對于腫瘤患者的治療提倡采用多種手段聯合的綜合治療，CAR-T過繼回輸治療與免疫檢查點抑制劑、靶向藥物等相結合，可獲得更好的療效[21-22]。本研究結果表明，SFN不僅促進記憶性T細胞的形成，還可增強其功能，因此將CAR-T細胞與SFN聯合治療可獲得更好的抗腫瘤效果。

綜上所述，本研究在體外實驗證明了經SFN處理后HER2 CAR-T細胞抗腫瘤功能得到增強，并揭示了SFN可能通過抑制HER2 CAR-T細胞糖酵解途徑促進記憶亞群形成，這為CAR-T細胞與SFN聯用治療腫瘤提供了實驗基礎。