食管癌組織中IDO1的表達及犬尿酸對間皮素CAR-T細胞功能的影響

劉裕琳，張 震，曹 玲，申春一，張 毅

1)鄭州大學第一附屬醫院生物細胞治療中心 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院腫瘤中心 鄭州 450052 3)河南省腫瘤免疫和生物治療重點實驗室 鄭州 450052 4)鄭州大學基礎醫學院免疫學教研室 鄭州 450001 5)鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001

免疫療法被認為是繼手術、放療、化療及靶向治療之后的腫瘤第五大治療手段[1]，如今免疫治療已在多種腫瘤中展現出良好的治療效果，并成為部分腫瘤的一線療法[2]。嵌合抗原受體修飾T細胞(chimeric antigen receptor T cells，CAR-T)是一種可以模擬T細胞受體(T-cell receptor，TCR)功能的人工受體T細胞，當嵌合抗原受體的抗體(配體)與腫瘤細胞表面的抗原(受體)結合時，通過鉸鏈區和跨膜區將信號傳遞至胞內并轉化為活化信號，激活的效應細胞通過分泌穿孔素或細胞因子殺傷腫瘤細胞[3-4]。CAR-T細胞治療在白血病等血液系統腫瘤中效果良好。但在實體瘤治療中，CAR-T細胞的進展一直相對滯后，并且在治療中存在很大的局限性，一個重要的原因就是在實體瘤中由于多種免疫逃逸種機制的作用，易形成腫瘤免疫抑制微環境，使CAR-T細胞功能受到了抑制[5-6]。吲哚加雙氧酶1(indoleamine 2,3-dioxygenase 1, IDO1)屬于含血紅素的單體氧化還原酶類，是介導人必需氨基酸色氨酸轉化為犬尿酸的代謝限速酶[7]，IDO1的代謝產物犬尿酸在發揮免疫抑制功能中起到重要的作用，最近有研究[8]發現清除體內的犬尿酸可以逆轉IDO1誘導的T細胞功能抑制，但是犬尿酸是否會影響CAR-T細胞的功能尚不明確。中國是世界上食管癌發病率、死亡率最高的國家之一[9]，并且患者的5 a生存率不超過20%。CAR-T細胞治療的出現，給食管癌的治療帶來了新的希望[10]。本文對食管癌組織中IDO1的表達與患者生存狀況進行了分析，觀察犬尿酸對間皮素CAR-T功能的影響。

1 材料與方法

1.1數據庫及臨床資料食管癌的基因表達數據及臨床資料均來自TCGA(The Cancer Genome Atlas，https://tcga-data.nci.nih.gov/)數據庫。從TCGA數據庫中收集186例食管癌腫瘤組織和12例正常食管黏膜組織中IDO1的基因表達數據；收集腫瘤患者10 a隨訪資料(終點為死亡)，剔除14例生存資料不完整的腫瘤患者，根據IDO1表達的中位數將患者分為高表達組(n=86)和低表達組(n=86)，繪制腫瘤患者的生存曲線。

1.2細胞的培養人胚腎293T細胞系和表達間皮素的食管癌細胞系KYSE510購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫，CD8+T細胞及間皮素CAR-T細胞從健康供者外周血中分離或轉染得到。293T細胞用DMEM-H培養基(美國Invitrogen公司)培養，KYSE510細胞、CD8+T細胞及間皮素CAR-T細胞用RPMI 1640培養基(美國Invitrogen公司)培養，培養基中分別加入體積分數10%的胎牛血清(美國Gibco公司)和100 U/mL的青霉素和50 g/L的鏈霉素，細胞均培養于37 ℃含有體積分數5%CO2的培養箱中。

1.3間皮素CAR-T細胞的制備及轉染效率鑒定人外周血單個核細胞的獲取及CD8+T細胞的磁分選參考文獻[11]。采用序列合成方法將識別間皮素抗原的間皮素-scFv連接至CD3和CD28的信號區，再將其克隆入慢病毒載體中，構建含間皮素抗原受體基因及其重組表達載體，并測序驗證間皮素CAR載體構建成功。培養人胚腎293T細胞密度達到70%～80%時，采用病毒包裝的方法將質?；旌衔锏稳?93T細胞中，繼續培養48、72 h后收集含病毒的上清液，感染CD8+T細胞，獲得間皮素CAR-T細胞。取間皮素CAR-T細胞于1.5 mL離心管中，PBS洗滌后直接上流式細胞儀檢測轉染效率，轉染效率達58.5%可以用于后續實驗。

1.4間皮素CAR-T細胞表面分子的檢測收集符合實驗的間皮素CAR-T細胞，分為對照組和犬尿酸處理組(加終濃度為200 μmol/L犬尿酸)，培養48 h后，收集2組細胞于1.5 mL離心管中，用PBS洗滌，再分別避光加入CD8-APC-Cy7、CD28-APC和PD-1-PE-Cy7流式抗體(美國Biolegend公司)4 ℃孵育20 min，上流式細胞儀檢測。

1.5間皮素CAR-T細胞胞內因子分泌的檢測分別在兩細胞中加入佛波酯(PMA，50 mg/L)及離子霉素(750 mg/L)，培養箱中孵育1 h后，加入阻斷劑布雷非德菌素A(brefeldin A，BFA)(美國Sigma公司)，充分混合，繼續培養 5 h。收集細胞于1.5 mL離心管中，用PBS洗滌，用固定劑重懸，4 ℃避光孵育30 min。離心棄上清后，加入破膜劑，4 ℃避光孵育30 min。離心棄上清后再加入破膜劑重懸細胞，分別避光加入CD8-APC-Cy7、IFN-γ-PE-Cy7和IL-2-APC流式抗體4 ℃孵育15 min，上流式細胞儀檢測。

1.6間皮素CAR-T細胞殺傷能力的檢測將2組間皮素CAR-T細胞與KYSE510按效靶比10∶1共孵育，6 h后收集細胞，PBS清洗，避光加入CD8-APC-Cy7和CD107a-APC流式抗體，上流式細胞儀檢測KYSE510細胞凋亡率，表示間皮素CAR-T細胞的殺傷能力。

1.7統計學處理采用SPSS 19.0或GraphPad Prism 7進行數據分析，應用Kaplan-Meier法繪制食管癌患者生存曲線并行log-rank檢驗，應用兩獨立樣本的t檢驗比較2組間皮素CAR-T細胞表面分子、細胞內因子分泌水平和細胞殺傷能力的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1食管癌組織中IDO1的表達與患者預后的關系IDO1在食管癌組織中的表達(2.647 ±0.139)高于食管正常組織(0.798±0.142)(t=3.368，P<0.001)。食管癌患者中IDO1低表達組和高表達組的生存曲線差異有統計學意義(χ2=4.547，P=0.033)，IDO1低表達組中位生存期(42.1個月)較高表達組的中位生存期(18.9個月)更長(圖1)。

圖1 2組食管癌患者的生存曲線

2.2犬尿酸對間皮素CAR-T細胞表面分子和細胞內因子分泌的影響見表1。由表1可知，與對照組相比，犬尿酸處理組間皮素CAR-T細胞表面抑制性分子PD-1表達上調，而激活性分子CD28的表達下降，細胞內因子IL-2和IFN-γ分泌減少。

表1 2組間皮素CAR-T細胞表面分子和細胞內因子水平的比較(n=3)

2.3犬尿酸對間皮素CAR-T細胞殺傷能力的影響見表2。由表2可知，與對照組比較犬尿酸處理組間皮素CAR-T細胞殺傷功能標志物CD107a表達降低KYSE510細胞凋亡率降低。

表2 犬尿酸對間皮素CAR-T細胞殺傷能力的影響(n=3)

3 討論

間皮素CAR-T細胞治療已經在多種實體瘤中開展了多項臨床試驗，在Ⅰ期臨床試驗中，間皮素CAR-T細胞治療都顯示出良好的安全性和可行性[12]，但是卻并未像血液系統腫瘤一樣，展現出良好的治療效果。CAR-T細胞治療血液系統腫瘤效果較好的一個重要原因是CAR-T細胞發揮治療作用的部位是患者體內的淋巴和血管，這些部位都是血液細胞經常所處的環境，有足夠的資源供它們存活和攻擊腫瘤細胞。然而，許多實體瘤所處的微環境比較復雜，并且容易形成免疫抑制的微環境，抑制CAR-T細胞的功能，不利于CAR-T細胞發揮作用[13]。在殺傷性細胞的胞漿里有很多溶細胞顆粒(如CD107a)，當殺傷細胞活化時，CD107a會被釋放到細胞接觸面，促使靶細胞死亡；因此，檢測間皮素CAR-T細胞表面的CD107a可以反映其殺傷能力。本研究發現，在食管癌組織中免疫抑制分子IDO1 表達水平增高，并且IDO1表達水平越高，食管癌患者的預后越差。因此IDO1的表達可能是食管癌微環境中影響CAR-T細胞治療的一個重要因素。

有研究報道，在腫瘤微環境中，多種細胞因子可以誘導IDO1的表達，如IFN-γ[14]、IL-1和TNF-α等[15]。在實體瘤治療過程中，CAR-T細胞釋放大量的IFN-γ來發揮殺傷腫瘤的作用，而由于腫瘤負反饋調節機制的存在，腫瘤組織中 IDO1表達明顯上調來逃逸免疫系統的監視。研究[16]顯示，EGFR CAR-T細胞治療的腦膠質瘤復發患者中，許多免疫抑制分子高表達，特別是IDO1和FoxP3，也有部分患者IL-10、PD-L1和TGF-β表達較高。另有研究顯示IDO1表達上調，其代謝產物犬尿酸也大量增加，犬尿酸可以與芳烴受體結合，從而引起一系列生物效應，包括抑制T細胞的活性[17]，誘導樹突狀細胞的激活以及誘導Treg的產生等[18-19]。本研究結果顯示，犬尿酸可以直接抑制CAR-T細胞的細胞活性和殺傷腫瘤細胞的能力，因此很有可能是CAR-T細胞治療過程中誘導的IDO1表達上調抑制了CAR-T細胞的功能。

綜上所述，IDO1在食管癌組織中的表達高于正常組織，并且其表達與腫瘤患者的不良預后有關。IDO1能夠通過其代謝產物犬尿酸抑制間皮素CAR-T細胞的活性和殺傷腫瘤的能力，提示在間皮素CAR-T細胞治療過程中，如果可以將IDO1抑制劑與間皮素CAR-T細胞聯合使用，可能增強間皮素CAR-T細胞的治療效果。