MS-275聯(lián)合順鉑對食管鱗狀細(xì)胞癌EC9706細(xì)胞氧化損傷和凋亡的影響

劉騰飛，王亞蘋，李 亞，張振坤，李 喆，周馨魁，張璐玉，王文杰，劉紅濤，張彥婷，關(guān)方霞，馬珊珊

鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州450001

食管癌是世界上常見的消化道惡性腫瘤之一，在我國，每年新發(fā)病例超過22萬例，死亡超過20萬例[1]。食管癌根據(jù)病理特征主要分為鱗狀細(xì)胞癌(鱗癌)與腺癌，在我國以鱗癌為主。順鉑(cis-diammine-dichloroplatinum，DDP)是臨床治療食管鱗癌的主要化療藥物之一，屬于細(xì)胞周期非特異性藥物，無明確的靶向組織，引發(fā)的不良反應(yīng)也較多，其中腎毒性是DDP在臨床上大量使用的主要限制因素之一[2]。MS-275是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，具有廣泛的抗人類腫瘤作用，對正常細(xì)胞的毒性小且臨床耐受性強[3]。本課題組前期的研究[4]表明，MS-275可降低食管鱗癌KYSE-70細(xì)胞存活率，有效抑制細(xì)胞遷移，阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。有研究[5-7]表明MS-275和DDP均能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原水平發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究旨在探討MS-275聯(lián)合DDP對食管鱗癌EC9706細(xì)胞氧化損傷和細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)而揭示MS-275聯(lián)合DDP對食管鱗癌的抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑EC9706細(xì)胞由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院細(xì)胞生物學(xué)實驗室保存，使用含體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% 的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。MS-275和DDP(美國MCE公司產(chǎn)品)，F(xiàn)BS、RPMI 1640培養(yǎng)基購自以色列BI公司，CCK-8 試劑盒和Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自蘇州宇恒生物科技有限公司，活性氧(reactive oxygen speies,ROS)檢測試劑盒和JC-1 線粒體膜電位熒光探針購自北京索萊寶公司， 丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，兔源Bax和Bcl-2購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，鼠源硫氧還蛋白(thioredoxin,Trx)抗體購自美國圣克魯斯生物技術(shù)公司。

1.2MS-275和DDP作用濃度的篩選收集EC9706細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度至4×103個/mL，接種于96孔板中。待細(xì)胞貼壁后，分別加入0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 μmol/L MS-275或0.25、0.50、1.00、2.00和4.00 μmol/L DDP，設(shè)空白孔(僅加培養(yǎng)液)、對照孔(加培養(yǎng)液和細(xì)胞)，每個處理設(shè)置3個復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔更換成100 μL含體積分?jǐn)?shù)10% CCK-8溶液的無血清培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的吸光度(A)值。細(xì)胞存活率=(A對照孔-A實驗孔)/(A對照孔-A空白孔)×100%。

1.3實驗分組將EC9706細(xì)胞分為空白對照組、MS-275組、DDP組和聯(lián)合(MS-275+DDP)組。MS-275和DDP濃度分別為2.0和1.00 μmol/L，作用48 h。

1.4細(xì)胞存活和凋亡情況檢測細(xì)胞分組培養(yǎng)48 h后，用不含EDTA 的胰蛋白酶消化，離心棄上清，PBS洗滌2次，加入500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，然后按照要求加入Annexin V-FITC和PI，在室溫避光條件下反應(yīng)5～15 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。實驗重復(fù)3次。細(xì)胞存活情況的檢測同1.2。

1.5細(xì)胞線粒體膜電位檢測細(xì)胞分組同1.3，于6孔板繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)液并用PBS洗滌2次，分別加入1 mL含F(xiàn)BS的RPMI 1640培養(yǎng)基和1 mL的JC-1染色工作液，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min，然后吸棄上清，用1×JC-1染色緩沖液洗滌2 次，加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，熒光顯微鏡下觀察并拍照。熒光強度用Image J測量。用紅綠熒光強度的相對比衡量線粒體去極化的比例，代表線粒體膜電位的變化。實驗重復(fù)3次。

1.6細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測細(xì)胞分組同1.3，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞并懸浮于用無血清培養(yǎng)基稀釋好的 DCFH-DA 中，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次。30 min后上流式細(xì)胞儀檢測DCF的熒光強度(488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長)。實驗重復(fù)3次。

1.7細(xì)胞內(nèi)MDA含量、SOD和GSH-PX活力檢測細(xì)胞分組同1.3，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞并用PBS洗滌2次，利用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，使用BCA法測蛋白濃度后，按照試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)MDA含量、SOD和GSH-PX活力檢測。實驗重復(fù)3次。

1.8Western blot檢測細(xì)胞中Bax、Bcl-2和Trx蛋白的表達(dá)細(xì)胞分組同1.3，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，采用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA法測蛋白濃度后，加入適量5×Loading Buffer，100 ℃變性10 min，最后置于-80 ℃保存。采用SDS-PAGE進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，每孔上樣量為50～200 μg，然后依次經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育(兔源Bax和Bcl-2抗體按1∶2 000稀釋，鼠源Trx抗體按1∶200稀釋)、洗滌、二抗孵育(山羊抗兔HRP按1∶2 000稀釋，山羊抗鼠HRP按1∶2 000稀釋)、洗滌和曝光。用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。實驗重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 19.0分析。不同濃度DDP或MS-275單獨作用不同時間后EC9706細(xì)胞存活率的比較采用3×5析因設(shè)計的方差分析；應(yīng)用2×2析因設(shè)計的方差分析比較4組細(xì)胞存活率、凋亡率、線粒體膜電位、ROS水平、MDA含量、SOD和GSH-PX活力，以及細(xì)胞中Bax、Bcl-2和Trx蛋白表達(dá)的差異。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1MS-275和DDP對EC9706細(xì)胞存活的影響見表1和表2。MS-275和DDP對EC9706細(xì)胞存活的抑制作用均具有時間和劑量依賴性。選擇2.0 μmol/L的MS-275和1.00 μmol/L的DDP用于后續(xù)實驗。

2.24組EC9706細(xì)胞存活率和凋亡率比較由表3可知，MS-275和DPP均能降低細(xì)胞存活率，增加早期和晚期凋亡率，且兩者聯(lián)合有協(xié)同作用。

F時間=421.659,F濃度=262.915,F交互=34.049,P均<0.001

表2 DDP對EC9706細(xì)胞存活率的影響(n=3) %

F時間=110.238,F濃度=328.100,F交互=9.553,P均<0.001

表3 4組EC9706細(xì)胞存活率、凋亡率的比較(n=3) %

2.34組EC9706細(xì)胞線粒體膜電位的比較由表4可知，MS-275和DPP均可以使細(xì)胞線粒體膜電位下降，且兩者聯(lián)合有協(xié)同作用。

2.44組EC9706細(xì)胞ROS水平、MDA含量、SOD和GSH-PX活力比較由表4可知，MS-275和DPP均能增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平和MDA含量，降低SOD和GSH-PX活力，兩者聯(lián)合對細(xì)胞中ROS水平的影響有協(xié)同作用。

2.54組EC9706細(xì)胞中Bcl-2、Bax和Trx蛋白的表達(dá)見表5和圖1。MS-275和DPP均能增加Bax蛋白的表達(dá)，降低Bcl-2和Trx蛋白表達(dá)并減小Bcl-2/Bax比值，兩者聯(lián)合對細(xì)胞中Bcl-2和Trx蛋白表達(dá)的影響有協(xié)同作用。

表4 4組EC9706細(xì)胞ROS水平、MDA含量、SOD和GSH-PX活力比較(n=3)

表5 各組EC9706細(xì)胞Bcl-2、Bax和Trx蛋白的表達(dá)(n=3)

1～4:分別為空白對照組、MS-275組、DPP組和聯(lián)合組

3 討論

CCK-8試劑盒，是一種基于WST的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞存活和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒，可用于藥物篩選、細(xì)胞存活測定和細(xì)胞毒性測定等實驗。我們檢測不同濃度MS-275和DDP對EC9706細(xì)胞存活率的影響，篩選MS-275和DDP在后續(xù)實驗中的用藥劑量和時間。篩選標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[8]：細(xì)胞存活率在70%～80%范圍內(nèi)所對應(yīng)的MS-275和DDP單獨用藥劑量。故在后續(xù)實驗中采用2.0 μmol/L MS-275和1.00 μmol/L DDP。

MS-275是一種Ⅰ類組蛋白去乙酰化酶抑制劑，具有廣泛的抗腫瘤作用[3]。本研究結(jié)果顯示MS-275和DDP均可有效抑制EC9706細(xì)胞的存活，促進(jìn)其凋亡，兩藥聯(lián)合有協(xié)同作用。

線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個標(biāo)志性事件[9]。JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體基質(zhì)中，此時JC-1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。因此，通過紅綠熒光的比值或轉(zhuǎn)變可以檢測線粒體膜電位的變化。本研究結(jié)果顯示MS-275和DDP均可降低EC9706細(xì)胞線粒體膜電位，且兩者聯(lián)合有協(xié)同作用。以上結(jié)果提示MS-275和DDP可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

在正常生理狀況下，細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)(如SOD、GSH-PX等)能夠通過清除多余的ROS使細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)保持平衡。DDP進(jìn)入細(xì)胞后，可通過損傷呼吸電子傳遞鏈，使細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)MDA含量和ROS水平升高[7]。DDP也能通過降低GSH-PX和SOD活力，打破細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的平衡，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS異常積累[2]。本研究結(jié)果顯示MS-275和DDP均能增加EC9706細(xì)胞內(nèi)ROS水平和MDA含量，降低SOD和GSH-PX活力，兩者聯(lián)合對細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響有協(xié)同作用。

Bcl-2是公認(rèn)的細(xì)胞凋亡抑制基因，其主要生物學(xué)效應(yīng)有抑制細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞壽命，增加細(xì)胞的遷移、侵襲能力。Bcl-2可導(dǎo)致Ras和p53基因的點突變和缺失。細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)因子刺激后是否存活可取決于Bcl-2/Bax比值。抑制Bcl-2或誘導(dǎo)Bax的表達(dá)均可導(dǎo)致線粒體功能紊亂，促使細(xì)胞色素C的釋放[10]。另有研究[11]表明，Bcl-2在食管鱗癌的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果顯示，MS-275和DDP均可增加EC9706細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)，減小Bcl-2的表達(dá)，從而降低Bcl-2/Bax比值，且兩者聯(lián)合有協(xié)同作用。

Trx系統(tǒng)是一個廣泛分布的NADPH依賴性二硫化物還原酶系統(tǒng)，它能夠通過自身的還原酶活性來抵抗氧化應(yīng)激。Trx系統(tǒng)主要包括NADPH、Trx還原酶和Trx。其中Trx是一類小分子多功能蛋白，可直接清除ROS。有研究[12]發(fā)現(xiàn)Trx蛋白能夠維持細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的穩(wěn)定，抵抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，MS-275和DDP均可減少EC9706細(xì)胞中Trx蛋白的表達(dá)，且兩者聯(lián)合有協(xié)同作用。

綜上所述，MS-275和DDP聯(lián)合可有效誘導(dǎo)食管鱗癌EC9706細(xì)胞的氧化損傷和凋亡。