循環機械牽張對骨髓間充質干細胞成纖維分化的促進作用

王肖帆，王瑩瑩，王君敏，陳璐璐，徐 鋒，喬艷華，張志磊，任琛琛，胡孟彩，吳惠琰，王魯文，崔世紅，趙 冰

1)鄭州大學第三附屬醫院婦產科 鄭州 450052 2)鄭州大學基礎醫學院人體解剖學系 鄭州 450001 3)許昌市中心醫院婦產科 許昌 461000 4)鄭州大學第三附屬醫院保健部 鄭州 450052

盆底功能障礙疾病(pelvic floor dysfunction，PFD)是一種多因素導致的盆底支持組織薄弱而產生的疾病[1-2]，常見于中老年女性，嚴重影響其身心健康及生活質量。目前的治療手段尚不能完全修復受損組織[3]。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有再生能力強及多向分化的優點[4-5]，且可分泌促進組織修復的生物活性因子[6]。彈性蛋白(Elastin)和賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)均由成纖維細胞分泌，前者是盆底細胞外基質的核心蛋白[7-8]，其合成減少及結構改變均可導致PFD，后者是一種作用于細胞外基質的關鍵酶，參與膠原和Elastin的合成[9]。KDM4B是組蛋白去甲基化酶Jmjd2家族的一員[10-11]，能夠特異性去除組蛋白3第9位賴氨酸的三甲基化(H3K9me3)，在促進干細胞成骨定向分化、炎癥、腫瘤發生等過程中發揮重要作用[12]。循環機械牽張(cyclic mechanical stretch,CMS)可調節細胞外基質的合成和分泌[13-15]，在維持細胞穩態中發揮重要作用[16]。本研究旨在探討CMS及KDM4B在BMSCs成纖維分化中的作用及表觀遺傳學調控機制，從而為臨床上應用BMSCs治療PFD提供依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物和主要試劑7 d齡雌性SD大鼠購自鄭州大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(豫)2016-0004。Percoll分離液(美國Phamacia公司)，胎牛血清、胰蛋白酶、α-MEM培養基(Gibco公司)，KDM4B兔抗鼠多克隆抗體、Elastin兔抗鼠多克隆抗體、LOX兔抗鼠多克隆抗體 (英國Abcam公司)，GAPDH兔抗鼠多克隆抗體、HRP標記羊抗兔二抗(美國Cell Signaling Technology公司)，蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術有限公司)，pLVX-IRES-puro-KDM4B質粒、空質粒pLVX-IRES-puro、pLKO.1-KDM4B-shRNA慢病毒載體、pLKO.1-KDM4B-NC-shRNA對照載體、psPAX2質粒、pMD2.G質粒、Turbofect轉染試劑(Thermo Fisher Scientific公司)，EZ ChIP染色質免疫沉淀試劑盒、H3K9me3兔抗鼠單克隆抗體、KDM4B兔抗鼠單克隆抗體(美國Millipore公司)，qRT-PCR試劑盒(大連TaKaRa公司)。FX-5000 T Flexcell細胞應力加載系統(Flexcell國際公司)。

1.2BMSCs的分離、培養及鑒定參照文獻[17]分離、培養大鼠BMSCs，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態和生長狀況，培養至第3～7代備用。

1.3不同CMS刺激取第4代80%融合的BMSCs分為5組，即對照組，1%、2%、4%和10%CMS組。PBS潤洗1次，加入適量胰蛋白酶消化，計數后以1×105個/膜的密度培養于10 g/L明膠包被的硅膠膜上，培養24 h，后4組用FX-5000 T Flexcell細胞應力加載系統分別給予0.5 Hz，1%、2%、4%和10%的CMS刺激，每天8 h，持續1周，每3 d換液一次。對照組BMSCs不施加刺激，在同等條件下培養1周。培養結束立即收集細胞。

1.4Western blot法檢測Elastin、LOX和KDM4B的表達收集1.3中細胞，培養至90%融合時，用預冷的PBS漂洗3次，加入裂解液冰上裂解30 min。4 ℃，15 000×g離心10 min后收集裂解物，測定蛋白濃度，加入裂解液調整蛋白濃度一致；然后加入蛋白上樣緩沖液，95 ℃、10 min進行蛋白變性。上樣電泳，電轉移至PVDF膜，50 g/L牛血清白蛋白封閉1 h后加一抗(KDM4B兔抗鼠多克隆抗體、Elastin兔抗鼠多克隆抗體、LOX兔抗鼠多克隆抗體均按1∶1 000稀釋)，4 ℃ 孵育過夜，TBST充分洗滌后加HRP標記的二抗，室溫孵育1 h。顯影后掃描圖像，以GAPDH為內參，用Quantity One對Elastin、LOX和KDM4B條帶的灰度值進行半定量分析。實驗重復3次。

1.5上調或下調KDM4B的表達對BMSCs 中Elastin和LOX表達的影響

1.5.1 慢病毒過表達質粒及慢病毒shRNA載體的構建、包裝與純化 BMSCs分為4組，加入400 μL無血清DMEM后，分別加入1.5 μg 核心質粒(pLVX-IRES-puro-KDM4B質粒、空質粒pLVX-IRES-puro、pLKO.1-KDM4B-shRNA慢病毒載體、pLKO.1-KDM4B-NC-shRNA對照載體)，1.5 μg 相應的病毒包裝質粒及6 μL Turbofect，充分混勻，靜置20 min。將上述4組病毒混合液滴加至含單層HEK293細胞的培養基中，混勻后置于體積分數5%CO2、37 ℃培養箱中孵育，8 h后更換為完全培養基，48 h后收集細胞上清液，測定病毒滴度。

1.5.2 BMSCs細胞分組及慢病毒感染 取第3代約80%融合的BMSCs細胞傳代，以2×105個/孔的密度接種到6孔板中，待細胞融合度達50%～70%，吸去細胞培養液，加入1 mL 新鮮BMSCs完全培養液，分為5組：空白對照組、KDM4B過表達組、過表達對照組、KDM4B-shRNA組和陰性對照shRNA組(NC-shRNA組)，后4組分別加入1 μL 6 g/L聚凝胺和最佳感染復數為15的4組慢病毒液，空白對照組不加慢病毒液。感染16 h后，吸去上清液，更換細胞完全培養液繼續培養48 h。熒光倒置顯微鏡下觀察細胞的感染效果，計算感染率。最后用Western blot法檢測Elastin、LOX蛋白的表達，方法同1.4。實驗重復3次。

1.6染色質免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)分析根據EZ ChIP染色質免疫沉淀試劑盒說明書操作。具體操作如下。①細胞交聯固定：取第4代BMSCs分為10%CMS組及對照組，前者給予10%的CMS刺激，后者不施加刺激，在同等條件下培養1周。培養結束立即收集細胞，加入體積分數1%甲酸溶液，室溫下固定10 min后加甘氨酸，PBS洗滌2次，4 ℃、800 r/min離心3 min棄上清，加入1 mL含有蛋白酶抑制劑的SDS裂解緩沖液重懸細胞。②超聲斷裂染色質：按優化好的條件冰上斷裂細胞裂解液中的染色質，使染色質DNA成為400～800 bp的片段，4 ℃離心后保留上清。③免疫共沉淀：加入蛋白G-瓊脂糖小珠進行預清除，離心后取1%上清作為“Input”對照，剩余上清中分別加入1 μg H3K9me3兔抗鼠單克隆抗體和KDM4B兔抗鼠單克隆抗體；陽性對照中加入1 μg anti-RNA 聚合酶Ⅱ；陰性對照加入1 μg小鼠IgG抗體；4 ℃旋轉孵育過夜。次日加入蛋白質A/G瓊脂糖珠吸附抗原-抗體化合物，短暫離心后棄上清，順次用低鹽、高鹽、LiCl和TE緩沖液洗滌。④解交聯及DNA純化：向復合物及“Input”溶液中加入200 μL洗脫緩沖液，離心后取上清加入5 mol/L NaCl，65 ℃水浴孵育5 h，用離心柱純化回收DNA，用于1.7中檢測。

1.7BMSCs中Elastin和LOX啟動子區域H3K9me3和KDM4B DNA的檢測Elastin上游引物：5’-GATGGCGGGTCTGACAGCGGTAGT-3’， 下游引物：5’-GATGGAGGAGGTTGAGCAAGAGGAT-3’；陰性對照(8 kb)上游引物：5’-AGTCCATTGACCT TATGATCCAAC-3’，下游引物：5’-AATCGAAAATCGATTCGTCGTAT-3’。LOX上游引物：5’-ATG GTGCTCCCGGCTCGTCCCTTCT-3’，下游引物5’-AACTGCAAACTGCCACGTCCTCC-3’；陰性對照(8 kb)上游引物：5’-TCTTCCACTCGGTGCGTCT-3’，下游引物：5’-ATGTTCCCTGGGTAGGTAACTC-3’。反應體系：DNA模板2 μL，上、下游引物各0.8 μL，SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，滅菌蒸餾水補加至20 μL。反應條件：94 ℃預變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環。反應結束后取10 μL PCR 產物在20 g/L瓊脂糖凝膠上電泳，并測序。參照文獻[18]用2-ΔΔCt法計算目的基因的表達水平。實驗重復3次。

1.8統計學處理用SPSS 21.0處理數據。采用單因素方差分析比較不同CMS條件下BMSCs中Elastin、LOX和KDM4B蛋白的表達以及沉默或過表達KDM4B后Elastin和LOX蛋白表達的差異，采用兩獨立樣本t檢驗比較10%CMS條件下及對照BMSCs中Elastin和LOX啟動子區域H3K9me3和KDM4B DNA表達的差異。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1不同CMS條件下BMSCs中Elastin、LOX和KDM4B蛋白的表達見圖1、表1。隨著CMS刺激強度的增加，BMSCs中Elastin、LOX和KDM4B的表達水平升高，其中10%CMS下，Elastin、LOX和KDM4B蛋白的表達水平高于其他組。

1～5：分別為對照組，1%、2%、4%和10%CMS組

組別ElastinLOXKDM4B對照組0.42±0.010.13±0.010.08±0.011%CMS組0.67±0.02?#0.70±0.02?#0.50±0.01?#2%CMS組1.04±0.06?#0.92±0.01?#0.57±0.02?#4%CMS組1.07±0.10?#0.96±0.04?#0.65±0.02?#10%CMS組1.47±0.06?1.41±0.02?1.25±0.05?F144.3051 252.096801.778P<0.001<0.001<0.001

*：與對照組相比，P<0.05；#：與10%CMS組相比，P<0.05

2.2沉默或過表達KDM4B后BMSCs中Elastin和LOX蛋白的表達KDM4B-shRNA組BMSCs中Elastin和LOX表達水平低于空白對照組和NC-shRNA組；KDM4B過表達組中Elastin和LOX蛋白表達水平高于空白對照組和過表達對照組，見圖2和表2。

1～5：分別為空白對照組、NC-shRNA組、KDM4B-shRNA組、過表達對照組和KDM4B過表達組

圖2 沉默或過表達KDM4B后BMSCs中Elastin和LOX蛋白的表達

*：與空白對照組相比，P<0.05；△:與NC-shRNA組相比，P<0.05；#：與過表達對照組相比，P<0.05

2.310%CMS條件下BMSCs中Elastin和LOX啟動子區域H3K9me3和KDM4B mRNA的表達10%CMS條件下Elastin和LOX啟動子區域H3K9me3 mRNA的表達均低于對照組，而KDM4B mRNA的表達均高于對照組，見表3。

表3 10%CMS下Elastin和LOX啟動子區域H3K9me3和KDM4B DNA的表達(n=3)

3 討論

PFD與細胞外基質重構所致的盆底支持結構薄弱密切相關。成纖維細胞是盆底結締組織的主要組成部分[19-20]，可以合成和分泌細胞外基質蛋白(膠原蛋白、Elastin、氨基殼聚糖等)，這些細胞外基質蛋白在機械應力刺激作用下，在創傷愈合和組織重建中發揮重要作用[7]。

既往研究[21-22]表明，適當的CMS刺激可以調節細胞功能，如細胞增殖、遷移和旁分泌，還能夠維持結締組織的動態平衡。過度的拉力和細胞變形頻率會影響細胞的黏附強度，并可能破壞細胞骨架[23]。本研究顯示，0.5 Hz下1%、2%、4%、10%的CMS刺激均可促進BMSCs分泌Elastin和LOX，且以0.5 Hz頻率10%振幅的CMS誘導效果最好，這與本課題組前期的研究[17]結果相符。Ozaki等[24]通過研究不同牽張強度和時間下成纖維細胞中Ⅰ型膠原和核心聚糖的mRNA水平，也證實了10%為最佳CMS強度。Zhu等[25]發現，10%CMS可提高MSCs的血管生成能力。Song等[26]的研究也發現10%CMS可以促進BMSCs在體內和體外的成軟骨分化能力。

染色質中的組蛋白是高度保守的，但其N端可被不同的酶催化而發生甲基化、乙酰化、硫酸化、核糖基化等共價修飾，從而改變其與DNA結合的狀態，影響基因表達。其中組蛋白甲基化受甲基化酶和去甲基化酶調節。H3K9me3是一種常見的組蛋白修飾，在基因沉默、轉錄抑制中具有重要作用[11-12]。KDM4B是一種組蛋白去甲基化酶，可以特異性結合H3K9，使H3K9me3去甲基化成為H3K9me，從而去除H3K9me3的基因轉錄抑制作用[27]。本研究結果發現，KDM4B過表達增加了BMSCs中Elastin和LOX的蛋白表達水平，沉默KDM4B的表達則降低二者的表達，這表明KDM4B是BMSC分化為成纖維細胞的必要條件。Ye等[28]報道，KDM4B的缺失顯著降低了BMSCs在體外和體內的成骨分化能力。Lee等[29]也報道KDM4B過表達增強了BMSCs軟骨分化的能力，沉默KDM4B基因則降低了BMSCs的軟骨分化潛能。本研究結果顯示，10%CMS能夠增強LOX和Elastin啟動子區域KDM4B的蛋白水平，降低H3K9me3修飾水平。本研究首次證實了10%CMS可通過誘導KDM4B的表達來促進Elastin和LOX的合成，從而促進BMSCs的成纖維分化。

綜上所述，0.5 Hz下10%的CMS刺激可以通過誘導KDM4B的分泌和抑制H3K9me3的修飾水平上調Elastin和LOX的表達，從而促進BMSCs向成纖維細胞分化。本研究提供了一種新的誘導BMSCs向成纖維細胞分化的方法，為PFD的干細胞治療提供了實驗基礎。