VEGF與CD11c+HLA-DR+樹突狀細胞在OHSS發生中的相互作用

石森林，姜小花，宋文妍，姚桂東，金海霞，薛茹月

1)鄭州大學第一附屬醫院生殖醫學中心 鄭州 450052 2)煙臺工程職業技術學院 山東煙臺264006

卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome, OHSS)是在輔助生殖技術治療過程中產生的主要并發癥之一，其發病機制并不清楚，目前認為與卵泡過多發育和卵巢過度增大有關。研究[1]發現，卵泡的發育、成熟以及排卵的發生和黃體的形成是發生在卵巢上的一個受控的組織損傷和愈合的炎癥反應過程，在此過程中，免疫反應參與其中。樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)是機體功能最強的專職抗原遞呈細胞[2]，成熟的DCs能有效激活初始型T細胞，在啟動、調控和維持免疫應答方面起著重要的作用。成熟的DCs還是感知相應危險信號的一個關鍵因素，并且控制著炎癥的初始反應[3-4]。有研究[5]發現，在OHSS患者卵泡液內存在著CD11c+HLA-DR+DCs，并且其量及相關細胞因子IL-10、IL-12、IL-18、IL-23水平顯著高于未發生OHSS患者，提示CD11c+HLADR+DCs可能參與OHSS的發生。血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)亦存在于卵泡液中，并與OHSS的發生相關[6-8]。目前對VEGF與DCs關系的研究主要是在腫瘤中進行，而在人卵泡液中尤其在OHSS患者中，二者之間的關系尚未見報道。本研究擬在體外分化培養CD11c+HLA-DR+DCs，并用不同濃度的VEGF刺激，觀察CD11c+HLA-DR+DCs細胞因子合成能力的變化，進一步揭示OHSS的發病機制。

1 材料與方法

1.1卵泡液、主要試劑和儀器收集在鄭州大學第一附屬醫院生殖中心行體外受精-胚胎移植的OHSS患者(50例，OHSS組)和以因男方因素為單一病因且未發生OHSS的患者(50例，對照組)。VEGF及細胞因子ELISA檢測試劑盒購自美國RD公司，VEGF抗體購自以色列PROSPEC公司，流式細胞檢測所需單克隆抗體購自美國Beckman Coulter公司，溶血素購自法國Immunotech公司，重組人粒細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、二甲基亞砜(DMSO)、IL-4購自美國Sigma公司，淋巴細胞分離液購自美國GE Healthcare Bioscience公司，RPMI 1640和PureLink RNA Mini試劑盒購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒購自美國Applied Biosystems公司。

1.2卵泡液中VEGF含量的ELISA檢測設置6個標準品(美國RD公司)孔，分別加50 μL不同濃度的標準品；樣品孔內依次加入10 μL待測樣品(取卵日，取兩組研究對象的卵泡液，置于離心管內分離并收集上清液)+40 μL標準樣品稀釋液；除空白孔外，每孔加100 μL辣根過氧化物酶標記的VEGF抗體，37 ℃恒溫孵育1 h；孵育結束后將微孔板重復洗5次；加底物，并在37 ℃恒溫箱避光孵育 15 min；加終止液，測定各孔的光密度值度。以標準品質量濃度作橫坐標，對應光密度值作縱坐標，繪制標準曲線，計算樣品質量濃度。

1.3卵泡液中活化DCs的檢測將卵泡液1 700 r/min離心5 min，用PBS將離心后的細胞成分洗滌一遍；根據細胞計數將洗滌后的樣本制備成密度為(1～2)×106個/mL的細胞懸液。取100 μL細胞懸液，分別加入熒光標記的單克隆抗體(CD11c-PE/HLADR-ECD/CD45-PE-CY5)和對照抗體(IgG1-PE/IgG1-ECD/CD45-PE-CY5)；避光孵育15 min后，加入200 mL溶血素，振蕩混勻；5 min后1 700 r/min離心5 min，棄上清；再加入2 mL PBS，1 700 r/min離心5 min，棄上清后加入600 μL PBS混勻，上機檢測；采用貝克曼MXP軟件收集、分析數據。DC活化的標志分子是HLA-DR，其平均熒光強度代表DC的活化程度，數值大提示DC活化水平高。

1.4人DCs的培養、分化將60 mL健康女性肝素鈉抗凝外周血(由鄭州大學第一附屬醫院血庫提供)注入淋巴細胞分離液液面上層，800×g高速離心15 min，收獲淋巴細胞層細胞；用50 mL RPMI 1640完全培養液重懸所收獲的細胞并移至細胞培養瓶中，在37 ℃、5%CO2培養箱中靜置2～4 h后收獲的細胞為單核細胞，移入細胞培養瓶，輕搖培養瓶，將不貼壁的懸浮細胞吸掉，并加入10 mL RPMI 1640完全培養液將貼壁細胞輕輕清洗2次，之后根據細胞密度(調細胞密度為5×106個/mL)加入RPMI 1640完全培養液進行誘導培養；第3天，加等量的RPMI 1640培養液；第5天，加入DCs培養液并加IL-4(1.5 μg)、rhGM-CSF(5.0 μg)；第6天，細胞培養液中補加IL-4(1.5 μg)、rhGM-CSF(5.0 μg)，并加入TNF-α(0.25 μg)；培養24 h后所收獲的細胞主要為成熟DCs。按1.3篩選活化DCs。

1.5不同質量濃度VEGF刺激DCs后相關細胞因子表達的檢測

1.5.1 實驗分組 將CD11c+HLA-DR+DCs置入離心管，加入50 mL生理鹽水，800g×15 min 20 ℃離心，棄去上清液；重復3遍。在離心管中加DCs培養液，調DCs密度在1×105個/mL左右，吹打混勻后將DCs置于12孔板內，每孔1 mL。根據本實驗所檢測卵泡液中VEGF的濃度設計高、中、低3個質量濃度組(2.0、1.0、0.5 μg/L)及1個空白對照組，與DCs在培養箱中過夜培養24 h。

1.5.2 相關細胞因子mRNA表達的qRT-PCR檢測收集各組DCs，采用Trizol法提取總RNA，定量后取2 μg RNA，在梯度PCR儀上反轉錄合成cDNA，置于-80 ℃冰箱保存。PCR反應體系(共25 μL)：SYBR Select Master Mix 12.5 μL，cDNA 3.0 μL，上下游引物各1.0 μL，RNase-Free水7.5 μL。每個樣本設3個復孔。RCR反應條件：95 ℃預變性120 s，95 ℃變性30 s；58 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，共40個循環。以GAPDH作為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算各指標mRNA相對表達量。自行設計IL-10、IL-12、IL-18、IL-23、TNF-α以及GAPDH的引物，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具體引物序列見表1。

1.5.3 相關細胞因子蛋白表達的ELISA檢測 收集各組細胞培養上清液，ELISA法檢測相關細胞因子的蛋白表達，具體操作方法同1.2。

1.6統計學處理采用SPSS 17.0進行分析。應用兩獨立樣本的t檢驗比較OHSS組和正常對照組患者卵泡液中VEGF質量濃度、DCs活化水平的差異，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較不同質量濃度VEGF刺激CD11c+HLA-DR+DCs后相關細胞因子mRNA和蛋白表達的差異，采用Pearson相關分析兩組患者卵泡液中VEGF質量濃度與DCs活化水平的相關性，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1OHSS患者卵泡液中VEGF及DCs活化水平的相關性OHSS組卵泡液中VEGF質量濃度[(1.490±0.347) μg/L]顯著高于正常對照組[(0.941±0.244) μg/L](t=9.160，P<0.001)。OHSS組DCs活化水平(355.460±74.280)高于正常對照組(288.500±49.304)(t=5.980，P<0.001)。OHSS組和正常對照組VEGF與DCs活化水平均成正相關，相關系數分別為0.801和0.743(P<0.001)。

2.2人DCs的分離及鑒定誘導培養的第7天，可見細胞增大變圓，并且從貼壁、半懸浮狀態變為懸浮狀態，可見典型樹突狀突起；部分細胞聚集成團，突起相互交織；CD11c+HLA-DR+雙陽性DCs可達76.85%。

2.3不同質量濃度VEGF刺激CD11c+HLA-DR+DCs后相關細胞因子mRNA和蛋白的表達見表2、3。與空白對照組比較，用不同質量濃度VEGF刺激后CD11c+HLA-DR+DCs中IL-12、IL-23和TNF-α mRNA和蛋白表達均上調(P<0.05)，同時IL-10、IL-18蛋白分泌量也升高(P<0.05)。

表2 4組CD11c+HLA-DR+DCs相關細胞因子mRNA的表達(n=3)

*：與空白對照組比較，P<0.05

表3 4組CD11c+HLA-DR+DCs上清液內相關細胞因子蛋白的表達(n=3) ng/L

*：與空白對照組比較，P<0.05

3 討論

OHSS是一個復雜的病理生理過程，本研究體外實驗結果顯示，用相當于OHSS患者卵泡液內水平的VEGF刺激CD11c+HLA-DR+DCs后，IL-12、IL-23和TNF-α mRNA的表達均上調；隨著相關基因表達的上調，相對應的細胞因子分泌量也顯著升高。IL-12和TNF-a是Th1型細胞因子，主要介導炎癥的發生和T細胞免疫反應，IL-23結構和功能與IL-12相似，IL-23和IL-12單克隆抗體均可以使Th1型免疫反應發生增強[9]，促進炎癥的加重。IL-10是Th2型細胞因子，其作用與Th1型細胞因子相反，具有免疫抑制和抗炎作用。在正常情況下，Th1和Th2細胞之間保持相互平衡以維持正常的免疫狀態。由本研究結果可知，高濃度VEGF通過對CD11c+HLA-DR+DCs的作用，使整個免疫反應偏向Th1型，而Th1型免疫反應可加重炎癥反應；由此可以推知，在OHSS患者卵泡液內，高濃度的VEGF通過CD11c+HLA-DR+DCs促進卵泡液微環境的免疫反應偏向Th1型，從而加重卵泡微環境的炎癥反應。

既往對VEGF和DCs關系的研究大多在各種腫瘤中進行，且二者的關系多呈負相關[10-13]。但有研究[14-15]發現，在人卵巢癌組織中和高分泌VEGF的荷瘤鼠中發現了一種新型的細胞群，這種細胞群能夠共表達DCs和血管內皮細胞標志，且VEGF和DCs呈正相關。本研究結果顯示，在人卵泡液中，OHSS組和對照組VEGF均與DCs活化水平呈正相關，與文獻[16]報道DCs參與上調血管和淋巴產生的相關基因VEGFa、VEGFc是一致的。

VEGF介導了多種免疫細胞參與的炎癥級聯放大反應，其主要機制是：VEGF通過與內皮細胞表面的VEGFR-2結合激活蛋白激酶D1[17]，促進內皮細胞分泌生長調節致癌基因a和IL-8等趨化因子，這些趨化因子引起炎癥細胞如中性粒細胞、單核細胞、T細胞等在炎癥部位的聚集；內皮細胞與一些炎癥細胞在VEGF的刺激下合成大量的TNF-α等炎癥因子；而TNF-α反過來又可以促進一些炎癥細胞分泌VEGF，增強這些炎癥細胞的活化，從而形成一個正反饋的放大環路，不斷推動疾病進程。如在結腸癌中，VEGF的升高可促進腫瘤的惡性發展；而在肝癌中，通過治療降低VEGF，可以促進疾病的轉歸[18-19]。CD11c+HLA-DR+DCs表面也有VEGFR-2[20]，而VEGF又可以促進CD11c+HLA-DR+DCs分泌TNF-α等炎癥因子，這些炎癥因子又參與炎癥的級聯放大反應。因此，作者推測，高濃度VEGF可能通過與CD11c+HLA-DR+DCs表面的VEGFR-2結合促使IL-12、IL-23和TNF-α的分泌，從而進一步加重OHSS患者的炎癥反應，加重OHSS的病理生理過程。

總之，VEGF可能通過對CD11c+HLA-DR+DCs的作用加重卵巢的炎癥反應，從而參與OHSS的病理生理過程。因而更加深入地了解VEGF對CD11c+HLA-DR+DCs的作用及其調控機制和信號通路將會為生殖免疫的發展及相關疾病的臨床治療提供新的理論依據。