脂肪和滑膜來源間充質干細胞成軟骨分化能力的比較

王 洋，宋卓悅，連曉磊，李江南，丁 康，李廣恒

鄭州大學第一附屬醫院骨科 鄭州450052

膝關節骨性關節炎為骨科的常見病和多發病，發病原因有高齡、肥胖、外傷、遺傳等。多種細胞因子代謝紊亂，蛋白聚糖及Ⅰ、Ⅱ型膠原降解，透明質酸減少等原因共同導致關節內軟骨細胞代謝紊亂，最終導致骨性關節炎的發生[1-2]。目前尚缺乏有效的途徑來對抗軟骨細胞外基質的丟失和軟骨細胞的凋亡[3]。間充質干細胞是一類多向分化的干細胞，具有分化為軟骨細胞并治療軟骨病損的潛力[4]。研究[5-6]表明多種來源的間充質干細胞，如骨骼肌來源的間充質干細胞、滑膜來源的間充質干細胞(synovial-derived stem cells，SDSCs)、骨髓來源的間充質干細胞等可以用于膝關節早期骨性關節炎軟骨病損的治療。關節腔內注射間充質干細胞治療早期骨性關節炎已取得了良好效果[7-9]。本研究觀察了SDSCs及脂肪來源間充質干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)、炎性軟骨細胞(inflammatory chondrocyte，ICs)體外成軟骨分化能力的差異，以尋找更為合適的治療骨性關節炎軟骨病損的種子細胞。

1 材料與方法

1.1標本來源與主要試劑選擇鄭州大學第一附屬醫院骨科2016年12月至2017年12月行人工膝關節表面置換術的骨性關節炎患者，男10例，女10例，取其負重區髕下脂肪墊、滑膜組織以及剝離的軟骨進行原代培養?；颊呒凹覍倬橥?，實驗已通過鄭州大學倫理委員會批準(倫理批準號：81472136)。膠原酶Ⅵ、胰蛋白酶、阿爾新藍及番紅O試劑為美國Sigma公司產品；qRT-PCR試劑盒以及反轉錄試劑盒購自TaKaRa公司；DMEM培養基購自美國Gibco公司；ELISA檢測試劑盒購自eBioscience公司；山羊血清為北京索萊寶公司產品；Ⅱ型膠原抗體為北京博奧森生物技術有限公司產品；軟骨細胞誘導分化培養基(含100 μg/L骨形態發生蛋白4和10 μg/L轉化生長因子β3)為Lonza公司產品。

1.2ICs、ADSCs及SDSCs的分離、培養與鑒定取膝關節置換術中剝脫的炎性軟骨約1 g，用含青、鏈霉素的組織洗液洗滌5～8次，無菌有齒鑷固定，手術刀反復切割組織至糊狀，放入含有3 mL 2 g/L膠原酶Ⅵ的15 mL離心管中，37 ℃孵育1 h，加入1 g/L胰蛋白酶孵育30 min。取200目濾網過濾后的組織置于50 mL離心管中，1 100 r/min離心5 min，棄上清，加入PBS，再次離心，棄上清后加入含有體積分數10%胎牛血清的DMEM重懸，移入25 cm2培養瓶中，于37 ℃、體積分數5%CO2的細胞培養箱中培養并觀察。ADSCs及SDSCs的原代分離培養同上。參考文獻[10]的方法對3種細胞進行鑒定。

1.3ICs、ADSCs及SDSCs的成軟骨誘導分化培養取生長狀態良好的ADSCs、SDSCs、ICs，當細胞匯合率約70%時，消化并計數。2×105個細胞為一個3D混合培養體系，將這些細胞分裝到含有2 mL軟骨細胞誘導分化培養基的15 mL離心管中，1 100 r/min離心5 min，取上清于細胞培養箱中直立培養。第3天觀察，細胞從單層細胞轉化為3D球形或橢球形，2～3 d換液1次。

1.4觀察指標

1.4.1 細胞培養上清中IL-1、IL-6、IL-10水平的ELISA法檢測 收集3D培養第7、14、21天的培養上清，離心后取上清并轉移至1.5 mL EP管中，ELISA法檢測IL-1、IL-6和IL-10濃度，按試劑盒說明書操作。檢測波長450 nm或570 nm。

1.4.2 成軟骨分化的形態觀察 ①細胞團塊直徑測量：直立培養21 d后，將細胞團塊移至1.5 mL EP管中，并用體積分數4%的甲醛溶液固定。用1 mL的槍頭吸出團塊置于實驗臺上，游標卡尺測量直徑大小并留取團塊。②阿爾新藍染色：3D培養21 d后收集樣本，脫水、固定并做石蠟包埋及切片。60 ℃烘箱中玻片脫蠟4 h，二甲苯脫蠟40 min，然后梯度乙醇水化，蒸餾水沖洗8 min，體積分數3%醋酸分化2 min，阿爾新藍染色40 min，核固紅溶液復染5 min，自來水沖洗。最后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察拍照，利用Image J軟件對染色面積進行分析。③番紅O染色：直立培養21 d后，常規制片。60 ℃烘箱中玻片脫蠟4 h，二甲苯脫蠟40 min，梯度乙醇水化。將切片置于蘇木精工作溶液染色5～10 min，固綠(FCF)溶液染色5 min。于番紅O溶液中浸泡2 h，蒸餾水沖洗8 min。最后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察拍照，利用Image J軟件對染色面積進行分析。

1.4.3 Ⅱ型膠原的免疫組化檢測 直立培養21 d后常規制片。60 ℃烘箱中玻片脫蠟1 h，二甲苯脫蠟40 min，梯度乙醇水化，蒸餾水沖洗，檸檬酸鈉抗原修復液微波修復15 min，蒸餾水沖洗2 min，體積分數3%的H2O2阻斷內源性過氧化物酶10 min,蒸餾水沖洗，滴加山羊血清封閉液封閉1 h，Ⅱ型膠原一抗(1∶200稀釋)孵育，4 ℃過夜，二抗孵育約30 min，DAB顯色，蘇木精復染1 min，鹽酸乙醇分化5 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察拍照，利用Image J軟件對染色面積進行分析。

1.5統計學處理采用SPSS 22.0進行分析，3種細胞IL-1、IL-6、IL-10分泌水平，誘導分化細胞團塊直徑大小、成軟骨分化特異性染色結果的比較采用重復測量數據的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.13種細胞的形態及增殖能力見圖1。ICs、ADSCs及SDSCs均呈現出類成纖維細胞形態。其中ICs多為短梭形多分支，而另外2種細胞多為長梭形。

2.2誘導分化后3種細胞IL-1、IL-6、IL-10分泌水平的比較見表1。

2.33種細胞成軟骨分化結果的比較見圖2、表2。

A：ADSCs；B：SDSCs；C：ICs

表1 3種細胞培養上清中IL-1、IL-6、IL-10的水平(n=20) ng/L

A、B、C：分別是阿爾新藍染色、番紅O染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色

表2 3種細胞成軟骨分化結果比較(n=20)

3 討論

3D細胞培養技術利用磁懸浮技術為細胞提供更加接近體內微環境的生存條件，極大地提高了實驗的準確性[11]。有研究[12-13]表明滑膜干細胞有A、B兩種前體細胞，A細胞主要是巨噬細胞樣細胞，B細胞主要是成纖維細胞樣細胞。B細胞生長快且具有成纖維特性，被認為是軟骨細胞的前體細胞，且體外增殖速度明顯快于A細胞。SDSCs來源于B細胞，且其表面含有的CD105與成軟骨分化密切相關，同時與軟骨細胞有相似的基因表達譜。本研究在3D培養條件下通過成軟骨分化的Ⅱ型膠原免疫組化染色及特異性阿爾新藍、番紅O染色的實驗結果可以推測SDSCs具有與軟骨細胞相同的成軟骨分化標志物，且具有強的成軟骨作用。

研究[14-15]發現哺乳動物全身的脂肪組織來自于胚胎發育的中胚層，主要由棕色脂肪和白色脂肪組成。ADSCs主要由白色脂肪組織組成，具有抑制IL-6、TNF、MMP3及MMP13的生物學活性[16-19]。本研究發現在體外誘導分化過程中，ADSCs可以分泌大量的抗炎因子IL-10，而ICs分泌的促炎癥介質IL-1、IL-6較ADSCs有明顯的升高。我們可以推測ICs可能在早期骨性關節炎的發病過程中占主導作用，而ADSCs具有強的抗炎作用。

綜上所述，本研究模擬體內關節腔成軟骨的分化微環境，在體外條件下建立成軟骨分化體系，結果預測了SDSCs作為良好的種子細胞的可能性，同時也發現ADSCs作為抑制炎癥反應的輔助種子細胞的可能性。接下來將聯合利用ADSCs強大的抑制炎癥的作用和SDSCs強大的再生軟骨能力共培養，讓兩種細胞再生軟骨再生的能力最大化。