葛根素對(duì)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、凋亡和β-catenin、cyclinD1、Bax蛋白表達(dá)的影響

田 龍，黃 月，丁 娜

1)鄭州人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450003 2)河南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450003

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)創(chuàng)傷性疾病，近年來(lái)發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)[1]。SCI后，阻礙軸突再生的主要因素是星型膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte，AST)增殖活化、小膠質(zhì)細(xì)胞活化及膠質(zhì)瘢痕形成[2]。AST是CNS膠質(zhì)細(xì)胞中體積最大的一種。有研究[3-4]顯示，H2O2、缺氧等多種因素均可抑制AST活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而加重CNS損傷。因此，促進(jìn)AST增殖及抑制其凋亡對(duì)于SCI治療具有重要意義。葛根素是從葛根中提取的一種異黃酮化合物，可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，抑制腦缺血損傷后AST凋亡及抑制 tACPD誘導(dǎo)的AST腫脹和腦水腫,對(duì)CNS損傷具有保護(hù)作用[5-7]。本研究使用AST凋亡模型，探討葛根素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的AST活力和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物、試劑和儀器新生1～3 d的SPF級(jí)SD大鼠2只，體重3～5 g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；葛根素購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；β-catenin、cyclinD1和Bax抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；MTT、DMSO均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞凋亡試劑盒、流式細(xì)胞儀均購(gòu)自美國(guó)BD公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司。

1.2大鼠脊髓AST的分離、培養(yǎng)無(wú)菌條件下取出2只SD大鼠的脊髓組織，置于盛有預(yù)冷PBS緩沖液的培養(yǎng)皿內(nèi)，剝離血管及脊膜，PBS緩沖液沖洗、剪碎、離心，沉淀用2.5 g/L胰蛋白酶消化后棄上清，加含體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，混勻重懸后過(guò)200目篩網(wǎng)，以107～109個(gè)/L濃度轉(zhuǎn)移至含DMEM培養(yǎng)基的75 cm2培養(yǎng)瓶中，于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育1 h(差速貼壁，去除成纖維細(xì)胞)。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，將尚未貼壁的細(xì)胞懸液取出，以1.0×106個(gè)/mL濃度接種于培養(yǎng)皿，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3 d換液1次。培養(yǎng)8～9 d待細(xì)胞達(dá)90%生長(zhǎng)融合，37 ℃、260 r/min振蕩2 h，棄細(xì)胞懸液(棄除小膠質(zhì)細(xì)胞)，差速貼壁法除去少突膠質(zhì)細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌，換液，1 d后使用胰蛋白酶消化傳代。實(shí)驗(yàn)選用生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞。

1.3不同濃度H2O2誘導(dǎo)后AST活力的檢測(cè)待第3代AST長(zhǎng)至培養(yǎng)皿底部80%～90%面積時(shí)，以105個(gè)/mL濃度接種于96孔板，每孔100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞在96孔平底板呈單層鋪滿狀態(tài)，分別用0、100、200、400、600、800、1 000 μmol/L的H2O2處理24 h。然后每孔加20 μL MTT，于培養(yǎng)箱中常規(guī)孵育4 h，棄上清，每孔加150 μL DMSO溶液，低速振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4葛根素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的AST活力影響的檢測(cè)以105個(gè)/mL濃度接種生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代AST于96孔板，每孔100 μL，細(xì)胞分為3組：空白對(duì)照組(細(xì)胞未經(jīng)任何處理)、H2O2組(400 μmol/L H2O2處理AST 24 h)、葛根素+H2O2組(終濃度為1 mmol/L的葛根素處理AST 30 min后，用400 μmol/L H2O2處理24 h)，按照1.3方法檢測(cè)各組細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5葛根素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的AST凋亡影響的檢測(cè)采用Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。按照1.4分組處理細(xì)胞，胰蛋白酶消化，離心，棄上清，PBS洗滌，以每1×105個(gè)細(xì)胞加195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min，離心，棄上清，再加入190 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，加10 μL PI，混勻后冰浴，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6葛根素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的AST中β-catenin、cyclinD1和Bax蛋白表達(dá)影響的Western blot檢測(cè)按照1.4分組處理細(xì)胞后，PBS洗滌，RIPA裂解并提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。總蛋白與5×SDS-PAGE混合，100 ℃變性5 min。每孔上樣50 μg變性蛋白，經(jīng)100～120 g/L SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗(β-catenin、cyclinD1和Bax抗體均1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜，加1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜。使用ECL化學(xué)發(fā)光法通過(guò)Chem Gel Doc XR凝膠成像儀檢測(cè)，用光密度軟件Quantity One分析。以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行分析，各組AST活力和凋亡率，以及β-catenin、cyclinD1、Bax蛋白表達(dá)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1不同濃度H2O2對(duì)AST活力的影響見(jiàn)表1。隨著H2O2濃度增加，AST活力降低(P<0.05)。選擇400 μmol/L H2O2用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 不同濃度H2O2誘導(dǎo)后AST活力的比較

F=96.076,P<0.001；各組間兩兩比較，P均<0.05

2.2各組AST活力和凋亡率比較如表2所示，H2O2組AST活力低于空白對(duì)照組，而H2O2+葛根素組AST活力高于H2O2組(P<0.05)。H2O2組AST凋亡率高于空白對(duì)照組，而H2O2+葛根素組AST凋亡率低于H2O2組(P<0.05)。

表2 各組AST活力和凋亡情況比較(n=3)

*：與空白對(duì)照組比較，P<0.05；#：與H2O2組比較，P<0.05

2.3各組AST中β-catenin、cyclinD1和Bax蛋白表達(dá)的比較如圖1和表3所示，與空白對(duì)照組比較，H2O2組β-catenin和cyclinD1表達(dá)降低，Bax表達(dá)升高(P<0.05)。與H2O2組比較，H2O2+葛根素組β-catenin和cyclinD1表達(dá)升高，Bax表達(dá)降低(P<0.05)。

1～3：分別為空白對(duì)照組、H2O2組、H2O2+葛根素組

組別β-catenincyclinD1Bax空白對(duì)照組0.847±0.0670.442±0.0360.048±0.006H2O2組0.164±0.018?0.126±0.015?0.291±0.032?H2O2+葛根素組0.477±0.051#0.325±0.028?#0.177±0.020?#F141.89999.66191.116P<0.001<0.001<0.001

*：與空白對(duì)照組比較，P<0.05；#：與H2O2組比較，P<0.05

3 討論

已有研究[8-9]證實(shí)，阿爾茨海默癥、腦缺血、衰老等急慢性腦損傷中腦組織氧自由基含量明顯增加，長(zhǎng)時(shí)間的氧化損傷可影響神經(jīng)細(xì)胞功能。H2O2處理可導(dǎo)致AST形態(tài)改變及存活率降低，氧自由基水平及凋亡率升高[10]。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，由AST分泌的膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)具有神經(jīng)保護(hù)作用[11]。在大鼠脊髓半切損傷模型中，損傷后AST增殖、GFAP表達(dá)增加與后肢功能恢復(fù)、創(chuàng)傷性反應(yīng)減輕在時(shí)間上有一致性[12]。葛根素是從葛根中提取的一種異黃酮化合物，具有抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、減輕缺血再灌注損傷等作用[13-14]。研究[15]表明，葛根素可能對(duì)帕金森具有治療作用。已有研究[16]表明，1 mmol/L葛根素對(duì)AST損傷具有明顯保護(hù)作用，因此，作者選擇1 mmol/L的葛根素用于此次試驗(yàn)。結(jié)果顯示，H2O2處理可抑制AST活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而葛根素可逆轉(zhuǎn)H2O2對(duì)AST活力的抑制，減輕凋亡，提示葛根素可通過(guò)降低氧化損傷減輕AST損傷。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在細(xì)胞中廣泛存在，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、能量代謝、分化等過(guò)程的調(diào)控，在腫瘤、心血管系統(tǒng)疾病、CNS疾病等發(fā)生過(guò)程中具有主要作用[17-18]。β-catenin是Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，Wnt信號(hào)的激活可引起β-catenin在胞質(zhì)中積累，當(dāng)β-catenin積累至一定濃度時(shí)，可進(jìn)入胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子作用，影響cyclinD1、Bax、Survivin等下游基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)特性[19]。激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路可明顯降低H2O2誘導(dǎo)的AST凋亡[20]。cyclinD1是一個(gè)周期蛋白，Bax是Bcl-2家族的促凋亡蛋白。有研究[21-22]顯示，AST細(xì)胞增殖及凋亡與cyclinD1和Bax表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，H2O2可下調(diào)AST中β-catenin和cyclinD1的表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)；而葛根素可上調(diào)β-catenin和cyclinD1的表達(dá)，下調(diào)Bax的表達(dá)；提示葛根素可通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路減輕AST氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，葛根素可促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的大鼠AST的增殖，抑制其凋亡，從而減輕AST的氧化應(yīng)激損傷，機(jī)制與激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。鑒于以往及本研究結(jié)果，我們認(rèn)為葛根素是一種有效的神經(jīng)損傷治療藥物，值得進(jìn)一步深入研究。