白芍總苷對人骨關節炎軟骨細胞增殖及p38MAPK蛋白表達的影響

董良杰， 王勤儉，王單一，釋延醫，釋延無

1)河南省中醫院(河南中醫藥大學第二附屬醫院)骨傷病診療中心骨二科 鄭州 450000 2)河南中醫藥大學針灸推拿學院 鄭州 450008 3)少林藥局 河南登封 452400

骨關節炎又稱骨關節病、退行性關節炎，是一種因勞損、增齡、創傷等諸多因素引起的關節軟骨退化性損傷疾病，好發于老年人[1]。其主要特征表現為慢性關節疼痛、腫脹、僵硬，且伴有活動受限或關節畸形等，嚴重影響患者的生活質量和健康[2]。軟骨細胞對維持軟骨結構和功能具有極為重要的作用，多種信號因子及信號通路影響軟骨細胞的增殖、分化、黏附等，參與骨關節炎的發生發展過程[3-4]。近年來研究[5-6]發現p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)信號通路在骨關節炎發病中發揮重要作用，骨關節炎患者軟骨內磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)呈高表達，抑制p38MAPK信號通路能夠抑制人骨關節炎軟骨細胞凋亡及促炎因子的表達。白芍總苷是中藥白芍的主要有效成分，屬于糖苷類物質，具有止痛、消炎、免疫調節等作用，臨床上用于治療類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病，具有較好的療效[7-8]。目前研究[9]表明，白芍總苷能夠抑制人骨關節炎軟骨細胞分泌炎癥因子，且能夠促進細胞增殖，具有抑制骨關節炎的作用，但其作用的具體機制尚不清楚。本研究通過觀察白芍總苷對人骨關節炎軟骨細胞增殖、p38MAPK磷酸化水平的影響，探討白芍總苷治療骨關節炎的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 標本 選取河南省中醫院(河南中醫藥大學第二附屬醫院)需做關節置換手術的膝骨關節炎患者10例，符合中華醫學會骨科學分會骨關節炎診斷標準，年齡60～75歲。入院檢查排除結締組織增生性疾病和全身免疫性疾病。無菌手術中避開表面的纖維軟骨，取中心區域關節軟骨片，立即放入含有青鏈霉素雙抗的DMEM培養液中。組織標本的采集經過該院倫理委員會批準，患者和家屬知情同意。

1.1.2 主要試劑及儀器 白芍總苷購于中國食品藥品生物制品檢定所；RIPA裂解液、BCA蛋白定量檢測試劑盒購于美國Thermo公司；DMEM培養基、p38MAPK信號通路激動劑Anisomycin購于美國Sigma公司；青霉素、鏈霉素購于美國Hyclone公司；胎牛血清、胰蛋白酶購于美國Gibco公司；Trizol試劑購于美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒、SYBR premix Ex Taq 試劑盒購于大連寶生物工程有限公司；MTT檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；ECL發光檢測試劑盒購于日本TaKaRa公司；引物均由上海生工生物工程有限公司合成；p38MAPK抗體、p-p38MAPK抗體及二抗均購于美國CST公司。

1.2人原代骨關節炎軟骨細胞的分離和培養參照文獻[10]方法分離人骨關節炎軟骨細胞。在超凈工作臺上將軟骨組織切成約為1 mm3的小塊，用PBS(含青霉素和慶大霉素)清洗數次，加入2.5 g/L胰蛋白酶，置于37 ℃培養箱中消化0.5 h，再加入Ⅱ型膠原酶于37 ℃培養箱中消化16 h，每5 h收集細胞1次。將消化后的細胞經200目濾網過濾，移至EP管中，1 000 r/min離心5 min，吸棄上清液，以含體積分數10%胎牛血清的培養基洗滌細胞3次。將細胞接種于培養瓶，接種密度為1×105個/mL，置于37 ℃、含體積分數5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養。根據細胞生長狀態,每隔3 d更換一次新鮮培養液。待細胞生長至約90%匯合時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。取第3代對數生長期的細胞用于后續實驗。

1.3實驗分組將人骨關節炎軟骨細胞接種于96孔板中，分為4組，每組5個復孔。空白對照組：只加培養基；白芍總苷組：參考文獻[8]及預實驗結果，加入含白芍總苷(終濃度為8 μmol/L)的培養基；激動劑組：加入含Anisomycin(終濃度為2 μg/L)的培養基；聯合組：加入含白芍總苷和Anisomycin的培養基，兩者濃度同前。將各組細胞置于37 ℃、含體積分數5%CO2、飽和濕度的培養箱中繼續培養。

1.4MTT法檢測細胞增殖情況分組培養24、48、72 h后，采用MTT法檢測4組細胞的增殖能力，嚴格按試劑盒說明操作。檢測波長490 nm。以吸光度值來反映細胞的增殖能力。實驗重復3次。

1.5qRT-PCR法檢測細胞中Ki67、PCNA mRNA表達水平分組培養48 h后，收集細胞，用預冷的PBS洗滌2次。每孔加入Trizol 800 μL，室溫靜置5 min，用移液槍反復吹打細胞，然后轉移至EP管中，加入等體積氯仿充分振蕩15 s，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清至另一新的EP管中，加預冷的異丙醇，沉淀用體積分數70%的乙醇洗滌，用RNase-free ddH2O溶解，經Nanodrop檢測RNA的濃度和純度(A260 nm/A280 nm在1.9～2.1)。用反轉錄試劑盒合成cDNA，用SYBR premix Ex Taq試劑盒行熒光定量PCR。引物序列：Ki67-F為5’-CGGAGCACTTT GAAACACCA-3’，Ki67-R為5’-TGTCACGGCAGCGAGTTCTT-3’；PCNA-F為5’-AAGGGCTGAAGATA ATGCTGATA-3’，PCNA-R為5’-CATATACGTGCAAATTCACCAGAT-3’。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的 mRNA相對表達水平。實驗重復3次。

1.6碘化丙啶單染法檢測細胞周期分組培養48 h后，細胞經胰蛋白酶消化，離心收集至EP管中，去上清后加入預冷的PBS洗滌2次，用體積分數70%乙醇于4 ℃固定24 h，離心后以PBS洗滌2次，加入10 mg/L的RNase于37 ℃孵育30 min，再加入碘化丙啶37 ℃避光染色30 min，上流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.7Western blot法檢測細胞中p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達水平分組培養48 h后，收集細胞，加入RIPA于冰上裂解30 min，離心后收集總蛋白，BCA法測定蛋白濃度并定量。取40 μg蛋白樣品進行電泳(50 g/L濃縮膠、100 g/L分離膠)。濃縮膠電壓80 V，分離膠120 V。將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜上，轉膜條件為300 mA恒流轉膜120 min。將膜置于含脫脂奶粉的TBST中，于水平搖床上封閉 4 h。取出膜，分別與p38MAPK一抗(1∶500稀釋)、p-p38MAPK一抗(1∶500稀釋)4 ℃孵育過夜。加二抗(1∶3 000稀釋)室溫孵育2 h。ECL顯色，在凝膠成像系統上成像拍照。采用Image J圖像分析系統分析，以目的條帶與內參β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達水平。實驗重復3次。

1.8統計學分析采用SPSS 21.0進行統計分析；4組細胞增殖能力、細胞周期、p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表達水平的比較采用2×2析因設計的方差分析；白芍總苷組、激動劑組和聯合組Ki67、PCNA mRNA表達水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.14組細胞增殖能力及Ki67、PCNA mRNA表達水平的比較表1結果顯示，p38MAPK信號通路激動劑單獨作用抑制骨關節炎軟骨細胞的增殖，白芍總苷單獨作用促進細胞增殖，二者聯用作用相拮抗。表2顯示，白芍總苷可增強人骨關節炎軟骨細胞Ki67、PCNA mRNA的表達，p38MAPK信號通路激動劑則降低Ki67、PCNA mRNA的表達，二者聯用作用相抵。

表1 4組細胞增殖能力的比較(n=3)

表2 4組細胞中Ki67、PCNA mRNA表達的比較(n=3)

2.24組細胞周期的比較見表3。P38MAPK信號通路激動劑能夠阻滯細胞周期進展，白芍總苷能夠促進骨關節炎軟骨細胞周期進展，二者聯用作用相拮抗。

表3 4組細胞周期的比較(n=3) %

2.34組細胞中p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表達水平的比較結果見圖1和表4。P38MAPK信號通路激動劑可促進骨關節炎軟骨細胞中p38MAPK和p-p38MAPK蛋白的表達，白芍總苷可抑制細胞中p38MAPK信號通路的激活，兩者聯用作用相拮抗。

1：空白對照組；2：白芍總苷組；3：激動劑組；4：聯合組

組別p38MAPKp-p38MAPK空白對照組0.22±0.030.12±0.02白芍總苷組0.14±0.020.06±0.01激動劑組0.31±0.030.23±0.03聯合組0.25±0.030.14±0.01F白芍總苷(P)34.557(<0.001)54.759(<0.001)F激動劑(P)28.103(<0.001)78.332(<0.001)F聯合(P)12.109(<0.001)40.013(<0.001)

3 討論

目前大量臨床及基礎研究[11-13]已證實在骨關節炎軟骨損傷修復中傳統中藥可取得良好的治療效果。白芍總苷為傳統中藥白芍的有效成分，可抑制骨關節炎軟骨細胞凋亡，促進細胞增殖，改善軟骨損傷[14]。楊海波[15]的研究結果顯示，白芍總苷通過下調基質金屬蛋白酶MMP-1、MMP-3、MMP-9的表達，減緩兔膝骨性關節炎的發展；白芍總苷能夠通過調節Wnt信號通路的活化水平，抑制兔骨關節炎成纖維樣滑膜細胞的增殖。王歡等[16]的研究結果顯示，白芍總苷能夠調節滑膜成纖維細胞的細胞周期、增殖和凋亡，在炎癥的發生發展中發揮抑制作用。Zhu等[17]發現，白芍總苷能夠減少骨性關節炎模型大鼠血清MMP-13含量，上調軟骨蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的含量，起到軟骨修復的作用。

p38MAPK信號通路能夠調控軟骨細胞的增殖、凋亡、胞外基質代謝、炎癥因子分泌等過程，在骨關節炎病程中發揮重要作用。塞來昔布聯合雙醋瑞因通過調節JNK和p38MAPK信號通路可有效緩解大鼠骨關節炎[18]。外源性S100A11與RAGE結合，可通過調控p38MAPK信號轉導通路，上調MMP-13、ADAMTS-5和X型膠原蛋白的表達，下調Ⅱ型膠原蛋白表達，從而誘導軟骨細胞肥大和細胞外基質的降解[19]。龍鱉膠囊可抑制骨關節炎模型大鼠軟骨細胞中p38MAPK和NF-κB的過度激活，減輕炎癥反應[20]。

本實驗中，我們發現p38MAPK信號通路激動劑anisomycin單獨作用于人骨關節炎軟骨細胞后，細胞增殖能力降低，細胞中增殖相關基因Ki67和PCNA mRNA表達水平降低，同時S期和G2/M期細胞比例減小。S期和G2/M期比例可作為細胞增殖的指標[18]。而白芍總苷具有促進人骨關節炎軟骨細胞增殖的作用，表現為細胞增殖能力增強，細胞中增殖相關基因Ki67和PCNA mRNA表達水平升高，S期和G2/M期細胞比例增加；同時白芍總苷能夠抑制p38MAPK信號通路的激活。二者聯合使用，白芍總苷能夠拮抗anisomycin對細胞增殖的抑制作用。

綜上，本研究初步證明了白芍總苷能夠通過調控p38MAPK信號通路，促進人骨關節炎軟骨細胞增殖。后續研究中將觀察白芍總苷是否對其他骨細胞也有影響，以期從不同角度探究白芍總苷治療骨關節炎的可能機制。