右美托咪定后處理對大鼠腦缺血再灌注損傷組織的保護作用

李鄭琛,賈英萍,王 媛,姜麗華,齊金蓮

1)鄭州大學附屬兒童醫院麻醉科 鄭州 450018 2)鄭州大學第三附屬醫院麻醉科 鄭州450052

臨床工作中腦缺血的發生往往不可預知，很多情況下難以進行預處理干預，所以缺血后處理在臨床上的應用更有價值。右美托咪定是臨床手術麻醉過程中常用的鎮靜藥物，作為一種新型的高選擇性α2腎上腺素受體激動劑，其功能為鎮靜、抗焦慮、鎮痛、抑制交感神經活性、減少麻醉藥物用量以及穩定圍手術期血流動力學等，且無呼吸抑制作用[1]。已有研究[2-4]表明右美托咪啶預處理對缺血再灌注器官具有一定的保護作用。本研究中作者制作了大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，并應用不同濃度右美托咪定進行后處理，觀察其對大鼠腦缺血再灌注損傷組織是否具有保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物健康清潔級雄性Wistar大鼠72只，3～4月齡，體重250～300 g，由鄭州大學實驗動物中心提供。所有實驗動物術前1周自由飲水，使用標準飼料喂養，動物飼養環境溫度維持在23 ℃左右，12 h光照，12 h黑暗。

1.2實驗動物分組術前12 h禁食，但不禁止飲水。大鼠采用隨機數字表法分為4組，每組18只。均采用體積分數10%的水合氯醛(5 mL/kg)腹腔注射麻醉。假手術組(C組)：僅暴露頸外動脈，不造成缺血。缺血再灌注組(I/R組)：采用改良線栓法制備大鼠左側大腦中動脈再灌注模型[5-6]，于腦缺血60 min后再灌注，并由腹腔注射無菌生理鹽水1 mL。右美托咪定Ⅰ組(Ⅰ組)：同上造模，于腦缺血60 min后再灌注，同時由腹腔注射50 μg/kg右美托咪定。右美托咪定Ⅱ組(Ⅱ組):其他操作同Ⅰ組，但是給予100 μg/kg右美托咪定。

1.3大鼠神經功能評估于再灌注后第1、3、7天，由不了解分組情況的觀察者依據Zausinger評分法[7]對大鼠神經功能狀況進行評分。

1.4腦組織缺血區域形態觀察和組織梗死灶體積測量再灌注后第1、3、7天，神經功能評分后行深度麻醉，每組取3只大鼠，處死取新鮮腦組織，經體積分數10%甲醛溶液固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續冠狀切片，HE染色，光鏡下觀察缺血側核心區域以及半影區域的組織形態。再灌注后第3天另取3只大鼠，深度麻醉后處死，取腦組織速凍后，自視交叉向后作厚約2 mm的連續切片，置于20 g/L的TTC緩沖液中，37 ℃避光孵育30 min，光鏡下觀察結果并用LUZEX-F型圖像分析儀分析，計算腦梗死面積/全腦面積比值。

1.5統計學處理應用SPSS 21.0處理數據。采用重復測量數據的方差分析比較再灌注后不同時間4組大鼠神經功能評分的差異，采用單因素方差分析比較I/R組、Ⅰ組、Ⅱ組大鼠腦梗死面積/全腦面積比值，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組大鼠神經功能評分比較再灌注后第1、3、7天時，與C組比較，I/R組、Ⅰ組、Ⅱ組神經功能評分降低；與I/R組比較，Ⅰ組、Ⅱ組神經功能評分升高，見表1。

表1 各組大鼠神經功能評分比較

F組間=181.086，P<0.001；F時間=24.113，P<0.001;F交互=1.963，P=0.082;*：與C組比較，P<0.05;#:與I/R組比較，P<0.05

2.2各組大鼠腦組織形態觀察結果見圖1。再灌注后第1天，腦組織HE染色可見，C組大鼠大腦皮層神經元排列整齊有序，細胞結構清晰且多呈圓形，細胞核染為藍黑色，形狀大而圓，有1～2個核仁，胞質淡紅色，細胞間質紅色，結構較為緊密。再灌注后第1、3天，I/R組大鼠核心區神經細胞數量稀少，細胞核出現固縮，組織極其疏松，第7天其核心區有大量炎癥細胞浸潤；半影區細胞層次較難區分，排列紊亂，細胞數量減少，細胞核發生固縮，核仁染色質不清，出現間質水腫。再灌注后第1、3、7天，Ⅰ組和Ⅱ組的半影區相較于I/R組，神經細胞層次較為清晰，細胞數量明顯增加且形狀較為完整，間質水腫情況減輕。

2.3各組大鼠腦梗死面積/全腦面積比值比較再灌注后第3天，I/R組腦梗死面積/全腦面積比值為(28.80±2.28)%，Ⅰ、Ⅱ組分別為(18.40±2.30)%、(18.00±2.53)%，3組間相比，差異有統計學意義(F=184.610,P<0.001)，與I/R組相比，Ⅰ、Ⅱ組腦梗死面積/全腦面積比值降低(P<0.05)，但Ⅰ組和Ⅱ組間差異無統計學意義(P>0.05)。

A:C組再灌注后第1天；B、C、D：I/R組再灌注后第1、3、7天；E、F、G：Ⅰ組再灌注后第1、3、7天；H、I、J：Ⅱ組再灌注后第1、3、7天

圖14組大鼠缺血再灌注后腦組織HE染色(×200)

3 討論

大腦是高灌注、高氧耗、高代謝及低能量儲備的重要器官，因此腦缺血發生后臨床要積極恢復大腦血供，但再灌注將造成缺血組織的再次損傷，因此腦缺血再灌注損傷是臨床面臨的重要問題。右美托咪定預處理是在腦缺血模型制備前使用右美托咪定[8-9]，但臨床工作中的患者均為腦缺血后的患者，因此我們觀察了右美托咪定后處理對大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織是否有保護作用。

大腦對缺氧極其敏感，再灌注后一方面缺血缺氧區域血供和氧供有一定程度恢復，但再灌注后將引發氧自由基蓄積，興奮性氨基酸的神經毒性、鈣離子超載使損傷進一步加重[10-13]，以致出現細胞透明性病變、纖維化，大面積細胞損傷等病理現象。本研究結果顯示，I/R組大鼠的神經功能評分低，再灌注后第1天僅有1～2分，再灌注后第1、3天，核心區神經細胞數量稀少，細胞核出現固縮，組織疏松，第7天核心區有大量炎癥細胞浸潤，且半影區細胞層次較難區分，排列紊亂，間質水腫，充分說明缺血再灌注后有大量的脂質過氧化產物進入血液引起了一系列的炎性反應。

神經功能評分和腦梗死灶面積的測量是評價腦局部缺血模型成功的重要指標。神經功能評分是對動物模型的運動功能、本體感覺等進行評估，用于反映神經功能的損傷程度。梗死灶面積是評價腦缺血效應最直接的指標。本研究結果顯示，與C組即假手術組相比，再灌注后第1、3、7天，I/R組神經功能評分降低，腦梗死面積/全腦面積比值達(28.80±2.28)%，說明大鼠腦缺血再灌注模型構建成功；并且發現腦缺血60 min后再灌注大鼠腹腔注射不同劑量右美托咪定(Ⅰ組、Ⅱ組)后，大鼠神經功能評分均高于I/R組；再灌注第1、3、7天，HE染色可見神經細胞層次較為清晰，細胞數量明顯增加且形狀亦較為完整，間質水腫情況減輕；TTC染色也可發現Ⅰ組和Ⅱ組的腦梗死面積/全腦面積比值均小于I/R組，這可能與右美托咪定抑制缺血再灌注過程中臟器炎性反應和調節免疫系統有關[14]，具體作用機制還需進一步探討。

Nakano等[15]對右美托咪定使用劑量與腦保護作用之間的相關性進行研究，發現使用高劑量的右美托咪定非但不能對實驗動物起到腦保護作用，還會顯著減少腦血流量，從而引起腦低灌注，最終增加腦組織梗死面積，加劇腦缺血引起的損傷。本實驗發現，使用右美托咪定的Ⅰ組和Ⅱ組劑量不同，對缺血再灌注損傷的腦組織均有保護作用，但2組間差異并無統計學意義。因此，右美托咪定后處理對局部腦缺血再灌注大鼠腦組織有保護作用但可能并無劑量依賴性。