夏天無總堿對血管性癡呆大鼠海馬神經元凋亡及認知功能的影響

張惠琴，張 毅，周麗雅，吳瑞鵬，韋 佳，盧娟娟， 趙玉梅， 唐國忠

1)甘肅省人民醫院神經內科 蘭州 730000 2)甘肅省人民醫院團委 蘭州 730000 3)甘肅省人民醫院消化科 蘭州 730000 4)甘肅省人民醫院干部病房神經內科 蘭州 730000 5)東鄉縣人民醫院內科 甘肅東鄉 731400

血管性癡呆是由出血性腦病、缺血性腦病等腦血管疾病引起的認知功能障礙綜合征，是除了阿爾茨海默病以外的導致老年癡呆的第二大常見誘因。尋找有效的治療血管性老年癡呆的方法具有重大意義[1-2]。血管性癡呆的發病原因較為復雜，膽堿系統紊亂、神經元凋亡、興奮性氨基酸毒性等是目前已知的發病機制[1]。夏天無具有活血化瘀、鎮靜、降壓、止痛等功效，常用于治療高血壓、坐骨神經痛、偏癱。夏天無總堿是夏天無的有效活性成分，含有四氫巴馬汀、畢扣扣靈堿多種成分，具有抗心律失常、改善腦缺血、抑制血小板聚集等作用[3-5]。最近的研究[6]顯示，夏天無總堿具有防治血管性癡呆的作用，可以改善學習記憶功能。本實驗探討夏天無總堿對血管性癡呆大鼠海馬神經元凋亡、氧化應激等的影響，為血管性癡呆的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1動物與主要試劑2月齡SD雄性大鼠50只購自蘭州大學實驗動物中心，體重180～220 g；活化型Caspase-3(c-Caspase-3)抗體購自美國Santa Cruz Biotech公司；去甲腎上腺素(NE)檢測試劑盒購自上海博湖生物科技發展有限公司，5-羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、乙酰膽堿酯酶(AchE)檢測試劑盒購自上海鈺博生物科技有限公司，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性檢測試劑盒購自上海哈靈生物科技有限公司，TUNEL凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所，丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自北京吉美生物技術有限公司；夏天無總堿購自湖南醫藥工業研究所。

1.2模型的構建和分組大鼠分為對照組、模型組、0.3夏天無總堿組、0.6夏天無總堿組、1.2夏天無總堿組，每組10只。模型組和3個夏天無總堿組均成功建立血管性癡呆大鼠模型，夏天無總堿組大鼠每天分別給予0.3、0.6、1.2 mg/kg的夏天無總堿灌服30 d，對照組和模型組用等量生理鹽水代替。血管性癡呆大鼠模型的構建參照文獻[7]：按3.5 mL/kg給予體積分數10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，仰臥固定于手術臺，頸部皮膚消毒后切開，分離雙側頸總動脈，3.5 mg/kg硝普鈉腹腔注射，用動脈夾夾閉雙側頸總動脈10 min后，去掉動脈夾恢復10 min，反復2次。將青霉素粉末撒于手術處，縫合。對照組大鼠手術過程中不阻斷頸總動脈、不注射硝普鈉。

1.3Morris水迷宮實驗檢測大鼠的認知能力Morris水迷宮實驗方法參照文獻[8]。將大鼠按照頭朝池壁的方向置于水中，隨機選取東南西北4個位置中的1個，實驗以南為初始位置，觀察記錄其找到平臺的時間，即逃避潛伏期。大鼠在120 s內未找到平臺，引導其在平臺上停留約10 s，此時記錄其逃避潛伏期為120 s。每天上午9：00進行訓練，連續訓練5 d，記錄第6天的逃避潛伏期。撤掉平臺，將大鼠頭面向池壁置于水中，此時以東為起始位置，記錄其在120 s內跨越平臺次數。

1.4海馬組織內NE、DA、5-HT、AchE、SOD、GSH-Px、MDA水平檢測各組大鼠水迷宮實驗后立即斷頭取腦，剝離海馬區，分別用試劑盒檢測海馬區NE、DA、5-HT、AchE、SOD、GSH-Px、MDA水平，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5TUNEL法檢測海馬神經元凋亡取海馬區腦組織切片置于乙醇中，用體積分數3%的H2O2阻斷內源性HRP，以蛋白酶K消化，置于熒光素酶和TDT連接的核苷酸混合液中孵育，HRP抗熒光素酶抗體孵育，DAB顯色，乙醇脫水，二甲苯透明后，中性樹膠封片。每張切片選取5個視野(×400)觀察，陽性細胞(棕褐色)所占百分比即為細胞凋亡率。

1.6Western blot法檢測海馬區組織中c-Caspase-3蛋白表達水平在剝離出的海馬區組織中添加蛋白提取液，勻漿，置于冰上裂解20 min，4 ℃14 000×g離心20 min，吸取蛋白上清溶液，-80 ℃保存。按照BCA法檢測蛋白濃度后，配制120 g/L的分離膠和50 g/L的濃縮膠，每個孔內蛋白上樣量為40 μg，上樣前進行變性處理(同等體積的Loading Buffer 100 ℃5 min)。先將電泳電壓設置為80 V，蛋白進入到分離膠和濃縮膠的邊緣以后，把電壓設置為100 V，待溴酚藍完全跑出凝膠后終止電泳。設置200 mA電流，在冰水混合物上轉膜2 h。用50 g/L牛血清白蛋白在室溫封閉NC膜1.5 h后，加按1∶800稀釋的抗c-Caspase-3抗體4 ℃反應過夜。將NC膜置于1∶2 000稀釋的二抗反應液室溫孵育1.5 h。按照ECL方法化學發光。以c-Caspase-3與內參GAPDH條帶灰度值的比值作為c-Caspase-3蛋白表達水平。

1.7統計學處理采用SPSS 21.0分析，各組大鼠逃避潛伏期和跨越平臺次數，海馬組織中NE、DA、5-HT、AchE和MDA含量，SOD、GSH-Px活性，神經元凋亡率和c-Caspase-3蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析，組間比較用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組大鼠認知能力比較見表1。模型組大鼠逃避潛伏期長于對照組，跨越平臺次數少于對照組；0.3、0.6、1.2夏天無總堿組大鼠逃避潛伏期短于模型組，跨越平臺次數多于模型組。

表1 各組大鼠逃避潛伏期和跨越平臺次數的比較(n=10)

兩個指標兩兩比較，P均<0.05

2.2各組大鼠海馬組織中NE、DA、5-HT、AchE含量比較見表2。模型組大鼠海馬區NE、DA、5-HT、AchE含量低于對照組；0.3、0.6、1.2夏天無總堿組上述各指標含量均高于模型組。

表2 各組大鼠海馬組織中NE、DA、5-HT、AchE含量比較(n=10)

各指標兩兩比較，P均<0.05

2.3各組大鼠海馬神經元凋亡率及c-Caspase-3蛋白表達水平比較見圖1和表3。模型組大鼠海馬區神經元凋亡率和c-Caspase-3蛋白表達水平高于對照組；0.3、0.6、1.2夏天無總堿組神經元凋亡率和c-Caspase-3蛋白表達水平低于模型組。

1～5分別為對照組，模型組，0.3、0.6和1.2夏天無總堿組

圖1 各組大鼠海馬神經元c-Caspase-3蛋白水平的Western blot檢測

兩個指標兩兩比較，P均<0.05

2.4各組大鼠海馬區腦組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量比較見表4。模型組大鼠海馬區SOD、GSH-Px活性低于對照組，MDA含量高于對照組；0.3、0.6、1.2夏天無總堿組SOD、GSH-Px活性高于模型組，MDA含量低于模型組。

表4 各組大鼠海馬區腦組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量的比較(n=10)

各指標兩兩比較，P均<0.05

3 討論

血管性癡呆是老年癡呆發生的重要原因之一。膽堿能系統異常、神經元過度凋亡等是目前發現的血管性癡呆發生的機制[9]。乙酰膽堿是重要的中樞神經系統神經遞質，在學習記憶過程中發揮關鍵作用[10]。血管性癡呆的發生與乙酰膽堿合成減少密切相關。DA、5-HT、NE是單胺類神經遞質，參與大腦功能活動，是中樞神經系統的關鍵調控因子。本實驗結果表明，血管性癡呆模型大鼠的逃避潛伏期延長，120 s內跨越平臺次數減少，海馬區神經元凋亡增多，同時海馬區DA、5-HT、NE、AchE水平降低，說明成功構建了血管性癡呆大鼠模型。

夏天無是罌粟科植物伏生紫堇的全草或塊莖，具有降血壓、保肝、鎮痛、解攣等功效，含有30多種生物堿，以芐基異喹啉類居多，主要包括紫堇堿、四氫巴馬汀、紫堇爾明、普羅托品等[11]。夏天無可提高大腦皮層抗氧化能力，對于腦缺血、心律失常、肝損傷等具有治療作用[12-14]。本實驗結果顯示，夏天無總堿能明顯改善血管性癡呆大鼠的認知能力，提高海馬區DA、5-HT、NE、AchE含量升高，說明夏天無總堿可能通過改善神經遞質釋放提高血管性癡呆大鼠的認知能力。

組織或細胞內過量的氧自由基能夠誘導氧化應激，而過量氧自由基的積累與抗氧化酶系統功能缺失有關；SOD、GSH-Px是氧自由基清除劑，也是抗氧化系統中的重要組成部分，其活性降低將導致體內氧自由基不能被及時清除，從而引起氧化損傷；MDA是體內過氧化反應的產物，其表達水平升高標志著氧化損傷的發生。氧化應激與細胞凋亡密切相關，細胞內過量的氧自由基能夠誘導細胞內Caspase的激活，促進細胞凋亡發生，Caspase-3活化是細胞凋亡進入不可逆階段的標志[15]。本實驗結果顯示，夏天無總堿可降低血管性癡呆大鼠海馬區Caspase-3的活化水平，提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量，說明夏天無總堿能夠抑制血管性癡呆大鼠海馬區氧化應激和細胞凋亡的發生。

總之，夏天無總堿可改善血管性癡呆大鼠的神經功能，提高認知能力，其作用機制與改善神經遞質的釋放、降低氧化應激、減少海馬區神經元凋亡有關。夏天無總堿可能是治療血管性癡呆的有效藥物之一。