DKK3基因過表達對人瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和凋亡的影響

郭洪耀，喬軍波，林 斌，沙樹奎

1)南陽市中醫院燒傷整形科 河南南陽 473000 2)鄭州大學第三附屬醫院血管瘤外科 鄭州 450052

瘢痕疙瘩是一種在皮膚組織受損后發生異常愈合的良性皮膚瘤[1-3]。皮膚成纖維細胞過度增殖、細胞膠原分泌過剩以及相關細胞因子過量表達，可導致結締組織過度增生和變形，進而引發瘢痕的形成[4-5]。瘢痕疙瘩的形成往往伴隨著皮膚疼痛和異常瘙癢，不僅破壞皮膚美觀，還會給患者帶來心理壓力，嚴重影響人們的身心健康。目前，瘢痕疙瘩的主要治療方法有藥物、手術、激光、放射、冷凍等，然而單一的治療手段效果不理想，復發率高[6]。瘢痕疙瘩形成的主要效應細胞為成纖維細胞。研究[7]表明誘導成纖維細胞的凋亡以及抑制成纖維細胞的增殖和膠原合成有助于改善瘢痕疙瘩。DKK3屬于DKK家族中的一員，是一種重要的腫瘤抑制因子[8]。據報道[9-10]，DKK3在多種腫瘤中表達下調，上調其表達能夠抑制癌細胞的增殖并促進其凋亡。本研究探索DKK3過表達對人皮膚瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖和凋亡的影響,以期為瘢痕疙瘩的防治提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1標本來源選取南陽市中醫院燒傷整形科2011年1月至2017年12月21例瘢痕手術患者的皮膚瘢痕疙瘩組織；其中男12例，女9例，年齡15～30歲，病程6～12個月；取材部位：胸前4例，上肢11例，耳垂6例。所有患者均無瘢痕疙瘩治療史，無合并皮膚病、結締組織病，局部皮膚無感染和潰瘍。正常皮膚組織20例取自同時期因燒傷進行皮膚移植術后的剩余皮膚；其中男13例，女7例，年齡23～35歲；取材部位：上肢內側或腹部。所有患者均對本研究知情同意。

1.2主要試劑DEME-F/12培養基和胎牛血清(美國Gibco公司)，CCK-8試劑(北京Solarbio科技有限公司)，cDNA反轉錄試劑盒(美國Invitrogen公司)，Annexin V-FITC/PI試劑盒(大連Meilunbio生物技術有限公司)，DKK3、CAPDH一抗和HRP羊抗兔二抗(美國Abcam公司)，Lipofectamine 3000轉染試劑盒(美國Thermo Fisher公司)，pcDNA3.0質粒(BioVector NTCC典型培養物保藏中心)，引物由Invitrogen合成。

1.3正常皮膚和瘢痕疙瘩組織中DKK3mRNA檢測取凍存組織置預冷研缽，加液氮后研磨至粉末，移入勻漿器中，Trizol法提取總RNA，反轉錄為cDNA，以GAPDH為參照基因進行qRT-PCR。DKK3引物序列：上游5’-ACAGCCACAGCCTGGTGTA-3’，下游5’-CCTCCATGAAGCTGCCAAC-3’；GAPDH引物序列：上游5’-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。反應程序：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火延伸30 s。用2-ΔΔCt計算DKK3 mRNA相對表達水平。

1.4人皮膚瘢痕疙瘩成纖維細胞的獲取和培養將去除表皮和皮下脂肪的瘢痕組織剪成1 mm3大小的組織塊，用含有100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養基，于體積分數5%CO2的37 ℃恒溫培養箱中培養，3～4 d換液1次。待原代培養的細胞生長至單層時加入2.5 g/L胰蛋白酶消化，繼續傳代培養。選取第4～6代的成纖維細胞進行后續實驗。

1.5DKK3過表達質粒的構建和細胞轉染使用Primer Premier 6.0設計含有HindⅢ和BamHⅠ酶切位點的DKK3引物，上游為5’-CCCAAGCTTATG CAGCGGCTTGGGGC-3’，下游為5’-CGCGGATC CCTAAATCTCTTCCCCTCCCAGCAGT-3’。以cDNA為模板擴增，之后使用酶切酶連的方式構建pcDNA3.0-DKK3質粒。成纖維細胞分別轉染pcDNA3.0空質粒(pcDNA組)或pcDNA3.0-DKK3質粒(DKK3組)，未轉染的細胞為對照組，每組設3個復孔。使用Lipofectamine 3000進行轉染，操作步驟見說明書。

1.6Western blot檢測3組細胞中DKK3蛋白的表達水平取轉染48 h的各組細胞，離心收集沉淀，加入裂解液充分裂解后收集上清液，BCA法蛋白定量，沸水處理10 min后置冰中備用。取50 μg蛋白行120 g/L的SDS-PAGE，90 V電泳30 min，120 V至結束。將蛋白條帶轉移至PVDF膜，200 mA恒流轉膜45 min。使用50 g/L牛血清蛋白封閉3 h，加1∶1 000稀釋的一抗反應過夜，加1∶5 000稀釋的二抗室溫孵育1 h，化學發光法顯色，拍照保存并使用Image J軟件分析。以目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達水平。

1.7CCK-8檢測3組細胞增殖情況分別取轉染24、26、48、72 h的3組細胞，調整細胞濃度為4×104個/mL，接種于96孔板，每組設3個復孔。37 ℃培養48 h后，加入10 μL的CCK-8試劑，酶標儀檢測450 nm波長處的光密度(OD)值。

1.8Annexin V-FITC/IP雙染法檢測3組細胞凋亡情況取轉染48 h的各組細胞，離心去除培養液，加入胰蛋白酶消化，離心收集沉淀，使用預冷的PBS重懸細胞，重復2次。最后加入Annexin V-FITC和IP染液，24 h內上流式儀檢測。

1.9統計學處理應用SPSS 17.0分析，瘢痕疙瘩和正常皮膚組織中DKK3 mRNA表達水平的比較采用兩獨立樣本t檢驗，3組細胞增殖和凋亡情況比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗， 檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1瘢痕疙瘩和正常皮膚組織中DKK3mRNA的表達瘢痕疙瘩和正常皮膚組織中DKK3 mRNA的相對表達水平分別為(0.53±0.13)和(1.00±0.11)，差異有統計學意義(t=4.780，P=0.009)。

2.2各組細胞中DKK3蛋白的表達結果見圖1和表1。DKK3組細胞中DKK3蛋白的表達水平顯著上調。

1～3：分別為對照組、pcDNA組和DKK3組

組別nDKK3蛋白對照組31.00±0.06pcDNA組31.09±0.10DKK3組32.98±0.32?

F=96.991，，P<0.001；*：與其他兩組比較，P<0.05

2.3各組細胞增殖情況結果見表2。DKK3組細胞增殖能力降低(P<0.05)。

表2 各組細胞增殖情況比較(n=3)

*：與其他兩組比較，P<0.05

2.4各組細胞凋亡情況對照組、pcDNA組和DKK3組細胞凋亡率分別為(15.5±1.2)%、(16.4±1.3)%和(26.3±0.2)%，差異有統計學意義(F=100.793，P<0.001)，DDK3組高于對照組和pcDNA組(P<0.05)。

3 討論

瘢痕疙瘩是一種由成纖維細胞的異常增殖和膠原蛋白等細胞外基質的異常沉積造成的病理性疙瘩。近些年來，人們逐漸發現在瘢痕疙瘩中成纖維細胞的過度增殖和膠原的堆積沉淀可能與某些原癌基因和抑癌基因的突變有關[11-12]。本研究結果發現DKK3 mRNA在瘢痕組織中的表達水平下調，與Hahn等[13]報道的結果相一致。該研究結果提示DKK3可能在成纖維細胞的異常增殖中發揮著重要作用。

DKK3是近些年來新發現的一種抑癌基因，可以與Wnt信號傳導因子競爭性結合從而參與調控該通路的功能。在DKK3的蛋白結構中包含兩個富含半胱氨酸的結構域Cys-1和Cys-2，該區域是抑制Wnt通路的主要活性中心[14]。當細胞中Wnt與受體結合后，促使β-catenin從降解復合物上解離下來，β-catenin累積到一定量后進入細胞核中與TCF/LEF結合，Wnt/β-catenin通路被活化，進而發揮對靶基因的調控作用[15]。Wnt/β-catenin為Wnt的經典途徑，參與了細胞增殖、凋亡等多種生物過程[16]。由此可見，DKK3對腫瘤細胞的生物學功能有著重要影響。過表達DKK3可抑制肺癌細胞的增殖和侵襲并誘導癌細胞凋亡[17]；在胰腺癌中DKK3表達顯著下調，提高其表達水平能夠抑制腫瘤生長并促進其凋亡[18]；在結腸癌中DKK3同樣對癌細胞發揮著抑制作用[19]。該研究結果顯示，成功上調DKK3表達能夠顯著抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖并誘導其凋亡。

綜上所述，DKK3可能抑制瘢痕成纖維細胞的增殖并誘導其發生凋亡，豐富了瘢痕疙瘩發生發展的分子機制，也為以DKK3為靶點的瘢痕疙瘩的防治提供了實驗依據。然而，關于DKK3在瘢痕成纖維細胞中介導了哪些信號通路和基因發揮抑增殖和促凋亡作用的還有待深入研究。