中長(zhǎng)期慢性腦低灌注海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡及加減薯蕷丸干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

目前我國(guó)血管性癡呆(vascular dementia，VD)發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)[1]，約占癡呆的20%，是第二大癡呆的原因。血管性癡呆及混合性癡呆等老年性癡呆早期階段發(fā)生的慢性腦低灌注(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)導(dǎo)致神經(jīng)變性及神經(jīng)元凋亡，在癡呆發(fā)生中發(fā)揮重要作用[2]。雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷(bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO)可導(dǎo)致CCH[3]。業(yè)已證實(shí)：BCCAO后腦血流下降，7 d后，海馬并沒有減小，但CA1區(qū)神經(jīng)元的密度明顯下降[4]，2周后神經(jīng)元丟失并導(dǎo)致認(rèn)知功能損害。可見CCH在短期內(nèi)即可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元丟失。臨床上多數(shù)病人CCH狀態(tài)難以糾正，中長(zhǎng)期CCH條件下對(duì)海馬神經(jīng)元凋亡及炎癥影響研究不多。基于《金匱要略》薯蕷丸原方，融秘方益智靈[5]于一體化裁而來的加減薯蕷丸(modified Shuyu pills，MSP)，由山藥、熟地黃、杜仲、首烏、炙遠(yuǎn)志、茯苓等14味中藥組成，具有補(bǔ)腎填精、健脾益氣的功效。臨床上長(zhǎng)期服用可有效改善非癡呆型血管性認(rèn)知功能障礙[6]。本實(shí)驗(yàn)觀察中長(zhǎng)期CCH大鼠海馬CA1區(qū)Bax、Bcl-2、核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)表達(dá)、病理學(xué)改變及MSP的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠40只，體重(300±20)g，8～9周齡，購自湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK(鄂)2015-0018]。大鼠喂養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸研究所動(dòng)物房，光照/黑暗時(shí)間為14 h/10 h，溫度控制在(24±2)℃，濕度保持在(50±10)%，進(jìn)食及飲水自由。

1.2 造模方法 采用改良BCCAO方法制作CCH模型。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為手術(shù)組(28只)及假手術(shù)組(12只)。手術(shù)組采用異氟烷吸入麻醉，分次結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈方法造模。即先分離右側(cè)頸總動(dòng)脈并兩端結(jié)扎，從結(jié)扎中心剪斷頸總動(dòng)脈，后縫合皮膚并以青霉素4 000 U局部滴注預(yù)防感染；1周后以同樣方法處理左側(cè)頸總動(dòng)脈。假手術(shù)組不結(jié)扎及剪斷頸總動(dòng)脈，其余步驟同手術(shù)組。

1.3 干預(yù)措施 造模后，假手術(shù)組死亡1只，手術(shù)組死亡5只。雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后1周開始灌胃。將手術(shù)組按隨機(jī)數(shù)字表分為藥物組(12只)、模型組(11只)。藥物組以加減薯蕷丸提取物(湖北省中醫(yī)院制劑室提供，經(jīng)提純，濃縮為每毫升含藥材1 g)灌胃，按照10 g/(kg·d)劑量，共灌胃45 d；模型組及假手術(shù)組用生理鹽水灌胃，劑量、療程及方法同藥物組。

1.4 水迷宮實(shí)驗(yàn) 共進(jìn)行5 d，前4 d為定位航行實(shí)驗(yàn)，最后1 d為空間搜索實(shí)驗(yàn)。水迷宮實(shí)驗(yàn)采用成都泰盟科技公司的設(shè)備及軟件進(jìn)行檢查。定位航行實(shí)驗(yàn)每天進(jìn)行兩次，從4個(gè)不同象限中將大鼠面向池壁放入水中。計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算每個(gè)大鼠的航行距離及逃避潛伏期。如果大鼠在120 s內(nèi)找不到水下的平臺(tái)，則引導(dǎo)其到平臺(tái)并停留2 min，使其記憶平臺(tái)與周圍環(huán)境的關(guān)系，逃避潛伏期記為120 s。其余則按照實(shí)際時(shí)間和距離由計(jì)算機(jī)測(cè)算。最后1 d則撤除平臺(tái)，計(jì)算大鼠在120 s搜索過程中的跨越平臺(tái)次數(shù)，平臺(tái)所在象限(第一象限)游行時(shí)間及距離，總的游行距離。

1.5 動(dòng)物取腦 各組8只大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉(0.35 g/kg)，將其固定于解剖板上，剖開腹腔，暴露肝臟和橫膈膜，迅速剪開橫膈膜，打開胸腔，暴露心臟。將灌注針頭從心尖部位經(jīng)左心室插入升主動(dòng)脈，剪開右心耳，快速灌入生理鹽水100～150 mL，直至體循環(huán)血液沖洗干凈，流出清亮灌流液，待大鼠尾巴伸直，四肢顫抖停止時(shí)，觀察肝臟逐漸變成白色；再用4%多聚甲醛灌注(250 mL左右)，40 min左右斷頭取腦，分離出海馬組織，固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中12～24 h，行常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、蘇木素伊紅(HE)染色及免疫組化染色。

1.6 免疫組化分析 制備海馬石蠟切片，經(jīng)過抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、添加一抗(分別為小鼠anti-Bax，anti-Bcl-2及anti-NF-κB)、加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗IgG多聚體、滴加新鮮配制的DAB顯色液及Harris蘇木素復(fù)染。采集圖像，使用IPP6.0軟件對(duì)免疫組化照片進(jìn)行光密度分析，每張切片選取3張400倍照片做光密度分析，以平均光密度進(jìn)行比較分析。

2 結(jié) 果

2.1 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 水迷宮實(shí)驗(yàn)中，各組逃避潛伏期在第1天、第2天比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第3天開始，假手術(shù)組逃避潛伏期與模型組相比明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第4天藥物組逃避潛伏期下降較快，與假手術(shù)組接近，藥物組、假手術(shù)組與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表1。在空間搜索實(shí)驗(yàn)中，假手術(shù)組及藥物組跨越平臺(tái)次數(shù)多于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，平臺(tái)所在象限游行時(shí)間及游行距離長(zhǎng)于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；3組總游行距離及速度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見表2。

表1 各組大鼠Morris水迷宮定位航行逃避潛伏期比較(±s) s

與模型組同時(shí)間相比，1)P<0.05

表2 各組大鼠Morris水迷宮空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(±s)

與模型組相比，1)P<0.05，2)P<0.01

2.2 海馬CA1區(qū)病理學(xué)結(jié)果 假手術(shù)組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列3～5層，層次分明，相鄰細(xì)胞排列整齊致密，細(xì)胞質(zhì)均質(zhì)紅染，胞核大而圓，核仁清晰；模型組海馬CA1 區(qū)細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞排列紊亂稀疏，椎體細(xì)胞分1～3層，細(xì)胞形態(tài)不完整，胞漿內(nèi)可見空泡，細(xì)胞核深染、固縮，呈三角形或不規(guī)則形，核仁不明顯，部分細(xì)胞核消失；藥物組海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元排列較為整齊，椎體細(xì)胞明顯增多，排列5～7層，結(jié)構(gòu)相對(duì)正常。詳見圖1。

假手術(shù)組 模型組 藥物組

2.3 海馬CA1區(qū)免疫組化結(jié)果 Bax表達(dá)：模型組最高，與藥物組及假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；假手術(shù)組最低，與藥物組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Bcl-2：藥物組表達(dá)最高，與假手術(shù)組及模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；假手術(shù)組Bcl-2表達(dá)比模型組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。NF-κB：藥物組和假手術(shù)組均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，藥物組高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠海馬Bax、Bcl-2及NF-κB蛋白表達(dá)平均光密度值比較(±s)

與模型組相比，1)P<0.01；與假手術(shù)組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

3 討 論

海馬是學(xué)習(xí)記憶的重要中樞，短暫性腦缺血可導(dǎo)致選擇性神經(jīng)元死亡[7]，死亡率最高的是海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元，可見海馬神經(jīng)元對(duì)急性缺血異常敏感。與人類一樣，大鼠有一套完整的連接頸動(dòng)脈系統(tǒng)和椎動(dòng)脈系統(tǒng)的Willis環(huán)。在雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)后，雖然雙側(cè)頸動(dòng)脈被結(jié)扎，椎動(dòng)脈可通過Willis環(huán)代償，向頸動(dòng)脈供血區(qū)域提供血液。因此，雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎導(dǎo)致大鼠全腦的低灌注，而不會(huì)造成中風(fēng)[8]。經(jīng)多普勒血流測(cè)定：成功的雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎可使大腦血流下降70%[9]。本實(shí)驗(yàn)中通過改良BCCAO法分次結(jié)扎頸總動(dòng)脈，有利于觀察中長(zhǎng)期CCH海馬組織學(xué)改變。

水迷宮實(shí)驗(yàn)中，模型組定位航行和空間搜索實(shí)驗(yàn)均展現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶的障礙，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。藥物組較模型組明顯改善，表明MSP能改善中長(zhǎng)期CCH大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。從病理學(xué)檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)：模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元明顯丟失、胞漿空泡化、細(xì)胞器溶解及細(xì)胞核固縮、消失等改變，考慮與神經(jīng)元凋亡相關(guān)。藥物組較好保持了神經(jīng)元正常結(jié)構(gòu)且神經(jīng)元明顯再生，表明MSP對(duì)中長(zhǎng)期CCH大鼠海馬具有保護(hù)缺血神經(jīng)元，維持正常神經(jīng)結(jié)構(gòu)并促進(jìn)神經(jīng)元再生的作用。進(jìn)一步的免疫組化檢測(cè)中，假手術(shù)組Bax表達(dá)最低，模型組最高，藥物組較模型組明顯降低，表明中長(zhǎng)期CCH大鼠仍然有神經(jīng)元凋亡發(fā)生而MSP具有抗凋亡的作用；從Bcl-2表達(dá)來看：藥物組較模型組明顯升高，表明MSP能促進(jìn)中長(zhǎng)期CCH大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2表達(dá)，進(jìn)一步發(fā)揮抗凋亡的作用；從NF-κB表達(dá)來看，假手術(shù)組最低，模型組最高，藥物組較模型組明顯較低，表明中長(zhǎng)期CCH大鼠海馬仍有明顯神經(jīng)炎癥，而MSP能抑制NF-κB表達(dá)而調(diào)節(jié)局部炎癥狀態(tài)。

在腦缺血情況下，海馬CA1區(qū)的椎體神經(jīng)元可自發(fā)性再生[10]。從本實(shí)驗(yàn)中可看出，模型組椎體神經(jīng)元在中長(zhǎng)期CCH條件下繼續(xù)有神經(jīng)元凋亡和丟失，因此再生的神經(jīng)元在功能上仍難以代償受損的神經(jīng)組織而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙難以恢復(fù)。而MSP有效的對(duì)抗凋亡，再生的神經(jīng)元可有效促進(jìn)認(rèn)知功能恢復(fù)。研究表明：腦局部缺血后，持續(xù)的炎癥能增加腦損傷程度，比初期的炎癥更有害[11]，NF-κB激活可使腫瘤壞死因子-α(TNF-α)釋放達(dá)到極限[12]，導(dǎo)致明顯的神經(jīng)炎癥并促進(jìn)神經(jīng)元凋亡，抑制星型膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB激活可發(fā)揮抗凋亡的作用。從本實(shí)驗(yàn)中可看出中長(zhǎng)期的CCH可誘導(dǎo)明顯的炎癥并對(duì)凋亡有明顯的促進(jìn)作用，而MSP則能抑制炎癥而進(jìn)一步抗凋亡。

神經(jīng)元凋亡伴隨著VD發(fā)展，抗凋亡對(duì)于VD的恢復(fù)至關(guān)重要[13]。既往研究證實(shí)：MSP能明顯促進(jìn)VD大鼠海馬腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)mRNA表達(dá)[14]。BDNF能激活細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt信號(hào)通路，PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、存活及代謝[15-16]。激活的Akt通過調(diào)節(jié)下游的靶分子如Bcl-2 和Bax來抑制凋亡，維持細(xì)胞存活[17]。MSP對(duì)于中長(zhǎng)期CCH海馬可能通過促進(jìn)BDNF表達(dá)來發(fā)揮抗凋亡，保護(hù)神經(jīng)組織固有構(gòu)造從而預(yù)防癡呆的發(fā)生。

目前認(rèn)為腎虛腦消髓減為VD的重要病機(jī)。本方以山藥、熟地、首烏、杜仲等補(bǔ)腎益氣、填精生髓；并以黨參、白術(shù)、茯苓、山藥益氣健脾，補(bǔ)后天之本而強(qiáng)先天之本，以圖精充髓足而腦神靈敏自用。結(jié)合本研究可以看出，精髓實(shí)質(zhì)相當(dāng)于神經(jīng)元、突觸等精微構(gòu)造。因此，MSP填精益髓實(shí)質(zhì)在于抗缺血條件下的神經(jīng)元凋亡與促進(jìn)神經(jīng)再生，從而改善癡呆大鼠的認(rèn)知功能可能是其取得臨床良效的重要機(jī)制之一。