HPLC法測定芩杏清熱止咳顆粒中8種成分

王子凌云，梁 琨?，李國文

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200082）

芩杏清熱止咳顆粒由黃芩清肺湯加減而來，是課題組開發(fā)的復(fù)方中藥新藥，黃芩清肺湯源于元代羅天益所著 《衛(wèi)生寶鑒》 卷十七，由黃芩、梔子2味藥組成，主治肺燥所致的小便不通；芩杏清熱止咳顆粒由黃芩、梔子、桑葉、苦杏仁、甘草等中藥提取制備而成，具有清肺瀉熱、止咳平喘的功效，主治肺熱咳喘證。方中黃芩具有抗病毒、抗菌、抗氧化、抗腫瘤等作用［1-4］，黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素等黃酮類成分是其主要有效成分；甘草主要含甘草苷、異甘草苷等黃酮類成分，以及甘草酸等皂苷類成分，具有抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)心腦血管系統(tǒng)等作用［5-7］；梔子具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒等作用，其中環(huán)烯醚萜類成分梔子苷在梔子中含有量最高，也是活性物質(zhì)，可作為該藥材質(zhì)量控制的重要指標(biāo)，具有降低缺血對腦組織傷害［8］、保肝利膽［9］、清除羥自由基、抑制脂質(zhì)過氧化等作用［10］；苦杏仁具有鎮(zhèn)咳平喘［11］、抗炎鎮(zhèn)痛等作用［12］；桑葉具有降低血糖、抗氧化等作用［13-14］。

本實驗建立HPLC 法測定芩杏清熱止咳顆粒中黃芩、梔子、甘草主要有效成分黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素、梔子苷、甘草苷、異甘草苷、甘草酸的含有量，以期用于該制劑更全面的質(zhì)量控制，并確保其內(nèi)在質(zhì)量，更好地服務(wù)于臨床。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀，配置G1329B 自動進(jìn)樣器、G1311B 四元泵、G1316A 檢測器；AL104 電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；DL-120D 智能超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；Milli-Q 超純水機（美國 Millipore公司）。

1.2 試藥 漢黃芩素（B20489）、漢黃芩苷（B20488）、梔子苷（B21661）、甘草酸（B20417）對照品均購于上海源葉生物科技有限公司；異甘草苷（DR10672）對照品購于上海鼎瑞化工有限公司；黃芩素（05-2001）、甘草苷（05-1016）對照品購于上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心；黃芩苷（110715-201016）對照品購于中國食品藥品檢定研究院。芩杏清熱止咳顆粒（批號171015、171021、171026）。甲醇、乙腈為色譜純，磷酸等試劑均為分析純，均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素含有量測定

2.1.1 色譜條件 Diamonsil Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相 0.2% 磷酸（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～10 min，45% B；10～25 min，45%～55%B；25～28 min，55%～70%B；28～35 min，70%B；35～36 min，70%～45%B；36～45 min，45%B）；體積流量 1.0 mL／min；柱溫25 ℃；檢測波長 274 nm；進(jìn)樣量 10 μL。

2.1.2 溶液制備

2.1.2.1 對照品溶液 精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品適量，甲醇分別稀釋成 156.800、31.200、4.592、3.776 μg／mL，即得。

2.1.2.2 供試品溶液 精密稱取顆粒約0.1 g，置于 50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入 70% 乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（250 W、40 kHz）提取45 min，放冷，70%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，續(xù)濾液過 0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.1.2.3 陰性樣品溶液 取缺黃芩的陰性樣品適量，按 “2.1.2.2”項下方法制備，即得。

2.1.3 系統(tǒng)適用性試驗 取 “2.1.2”項下各溶液適量，在 “2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由圖可知，各成分色譜峰分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)大于6 000，陰性無干擾。

圖1 各成分HPLC 色譜圖（Ⅰ）Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents（Ⅰ）

2.1.4 線性關(guān)系考察 取 “2.1.2.1”項下對照品溶液 1、2、5、10、20 μL，在 “2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定。以進(jìn)樣量（X）對峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表1 各成分線性關(guān)系（Ⅰ）Tab.1 Linear relationships of various constituents（Ⅰ）

2.1.5 精密度試驗 取 “2.1.2.1”項下對照品溶液，在 “2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積RSD 分別為 0.20%、0.42%、0.83%、0.51%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取 “2.1.2.2”項下供試品溶液（批號 171015）適量，于 0、4、8、12、20、24 h 在 “2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積 RSD分別為 0.28%、1.7%、1.5%、1.0%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗 精密稱取顆粒（批號171015）約0.1 g，共6 份，按 “2.1.2.2”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素含有 量 RSD 分 別為 1.2%、1.5%、1.7%、1.4%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的顆粒（批號 171015）約 0.05 g，共 6 份，精密加入各對照品溶液（0.51 mg／mL 黃芩苷 4 mL、0.25 mg／mL漢黃芩苷 1 mL、0.039 0 mg／mL 黃芩素 1 mL、0.021 mg／mL 漢黃芩素 1 mL），按“2.1.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（Ⅰ， n=6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（Ⅰ， n=6）

2.2 梔子苷、甘草苷、異甘草苷、甘草酸含有量測定

2.2.1 色譜條件 Diamonsil Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相 0.05% 磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～15 min，13% B；15～20 min，13%～20% B；20～25 min，20% B；25～37 min，20%～50%B；37～43 min，50%～90%B；43～50 min，90%～13% B）；體積流量1.0 mL／min；柱溫 25 ℃；檢測波長 0～25 min，237 nm；25～33 min，360 nm；33～50 min，237 nm；進(jìn)樣量 10 μL。

2.2.2 溶液制備

2.2.2.1 對照品溶液 精密稱取梔子苷、甘草苷、異甘草苷、甘草酸對照品適量，甲醇分別稀釋成181.5、22.7、20.3、60.8 μg／mL，即得。

2.2.2.2 供試品溶液 精密稱取顆粒約0.3 g，置于 50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入 70% 乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（250 W、40 kHz）提取30 min，放冷，70%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過 0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.2.2.3 陰性樣品溶液 取缺梔子、甘草、梔子、甘草的陰性樣品適量，按 “2.2.2.2”項下方法制備，即得。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗 取 “2.2.2”項下各溶液適量，在 “2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖2。由圖可知，各成分色譜峰分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)大于6 500，陰性無干擾。

2.2.4 線性關(guān)系考察 取 “2.2.2.1”項下對照品溶液 1、2、5、10、20 μL，在 “2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定。以進(jìn)樣量（X）對峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表3，可知各成分在各自范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表3 各成分線性關(guān)系（Ⅱ）Tab.3 Linear relationships of various constituents（Ⅱ）

2.2.5 精密度試驗 取 “2.2.2.1”項下對照品溶液，在 “2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得梔子苷、甘草苷、異甘草苷、甘草酸峰面積RSD 分別為 0.77%、0.99%、0.93%、0.96%，表明儀器精密度良好。

圖2 各成分HPLC 色譜圖（Ⅱ）Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents（Ⅱ）

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取 “2.2.2.2”項下供試品溶液（171015）適量，于 0、4、8、12、20、24 h在 “2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得梔子苷、甘草苷、異甘草苷、甘草酸峰面積 RSD 分別為0.55%、1.2%、1.7%、1.2%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 精密稱取顆粒（171015）約0.3 g，共 6 份，按 “2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在 “2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得梔子苷、甘草苷、異甘草苷、甘草酸含有量RSD 分別為 0.67%、1.3%、1.2%、0.89%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的顆粒（171015）約 0.15 g，共6 份，精密加入對照品溶液 2 mL（0.85 mg／mL 梔子苷、0.09 mg／mL甘草苷、0.078 mg／mL 異甘草苷、0.29 mg／mL 甘草酸），按 “2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在 “2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算回收率，結(jié)果見表4。

表4 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（Ⅱ， n=6）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（Ⅱ， n=6）

2.3 樣品含有量測定 取3 批顆粒劑（171015、171021、171026），每批 3 份，按 “2.1.2.2”和“2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1.1”和 “2.2.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算含有量，結(jié)果見表5。

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇 芩杏清熱止咳顆粒中黃芩清上焦肺熱，為君藥，含有大量黃酮，是該藥材的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，目前已發(fā)現(xiàn)黃芩苷、黃芩素等黃酮及其苷類成分40 多種［15］，本實驗選擇含有量較高的黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素；環(huán)烯醚萜是梔子屬植物中的特征性成分，在芩杏清熱止咳顆粒中梔子苷含有量較高，可作為質(zhì)控成分；2015年版 《中國藥典》 將甘草苷、甘草酸作為質(zhì)控成分，是甘草清熱解毒、祛痰止咳的主要活性物質(zhì)［16］，而不同品種、產(chǎn)地藥材中異甘草苷含有量差異較大，故本實驗將甘草苷、異甘草苷、甘草酸一同作為指標(biāo)成分。

表5 各成分含有量測定結(jié)果（mg／g， n=3）Tab.5 Results of content determination of various consitituents（mg／g， n=3）

由于芩杏清熱止咳顆粒中各成分含有量、化學(xué)性質(zhì)差異較大，同一提取濃度、相同色譜分離條件無法同時準(zhǔn)確測定，故本實驗采用2種提取濃度、2種色譜條件分別測定。同時，桑葉中蘆丁、綠原酸，以及苦杏仁中苦杏仁苷等成分的測定條件與本實驗差別較大，擬另文發(fā)表。

3.2 檢測波長、流動相選擇 本實驗將各對照品溶液在200～400 nm 波長處進(jìn)行紫外全波長掃描，發(fā)現(xiàn)黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素最大吸收波長均在274 nm 附近，故測定黃芩中這4種黃酮類成分時選擇其作為檢測波長；梔子苷、甘草苷、異甘草苷、甘草酸最大吸收波長分別為237、276、360、252 nm，若用同一波長檢測將會降低某些成分靈敏度，參考2015年版 《中國藥典》，選擇237 nm 作為梔子苷、甘草苷、甘草酸檢測波長，360 nm 作為異甘草苷檢測波長。

測定4種黃酮類成分時，分別考察了水-甲醇、0.2% 磷酸-甲醇、水-乙腈、0.2% 磷酸-乙腈，發(fā)現(xiàn)以0.2%磷酸-甲醇為流動相梯度洗脫時，可達(dá)到較好的峰形和分離效果。然后，分別考察0.05% 磷酸-乙腈、0.05% 磷酸-甲醇、0.05% 三氟乙酸-乙腈、0.05%三氟乙酸-甲醇，最終確定0.05%磷酸-乙腈作為測定梔子苷、甘草苷、異甘草苷、甘草酸的流動相。

3.3 樣品處理方法選擇 本實驗分別考察了甲醇超聲提取、70% 乙醇超聲提取、70% 乙醇加熱回流，發(fā)現(xiàn)黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、甘草苷、異甘草苷、甘草酸采用70% 乙醇提取效果較好，并且超聲、加熱回流提取效果無明顯差異，考慮到操作方便，最終確定70% 乙醇超聲提取作為樣品處理方法。