參附注射液聯合左旋多巴對帕金森病小鼠黑質組織形態及酪氨酸羥化酶水平的影響

吳 艷，杜 娟，張曉雷

（南京醫科大學附屬腦科醫院，江蘇 南京 210029）

帕金森病是世界公認的第二大神經退行性疾病，但機制尚不明確［1］，其病理特點為腦中黑質多巴胺能神經元進行性死亡，導致黑質-紋狀體通路DA 合成減少直至不足，從而引起機體靜止震顫、肌強直、運動遲緩等運動癥狀［2］。多巴胺能神經元損傷導致多巴胺合成減少是發病的中心環節［2］，酪氨酸羥化酶（TH）是多巴胺合成限速酶，神經元攝取血中酪氨酸后通過TH 合成多巴，再經多巴脫羧酶生成多巴胺以維持正常機體功能［3］，故TH 的功能和表達對多巴胺合成有重要意義［4］。

目前，左旋多巴替代療法是臨床最常用的帕金森病治療方案，它可補充紋狀體中多巴胺不足，對肌強直和運動困難療效較好［5］，但使用過程中因為血漿Hcy 水平升高，易出現血管平滑肌細胞增生、氧化應激反應、動脈粥樣硬化形成，甚至失眠、抑郁、幻覺等中樞神經系統癥狀［6］，這與長期使用左旋多巴類藥物療效下降，甚至藥物不良反應增加有關，故該療法有其局限性［7］。參附注射液可緩解氣虛、陽虛癥狀，具有抗缺血、缺氧等作用，其主要成分是紅參和附片，可用于治療缺血缺氧導致的心腦血管疾病［8］，本實驗探討該制劑聯合左旋多巴對帕金森病小鼠黑質組織形態及酪氨酸羥化酶水平的影響，以期為相關治療提供參考。

1 材料

1.1 動物 健康 C57／BL6 小鼠，體質量（20±2）g，雌雄各半，購自上海靈暢生物科技有限公司，生產許可證號SCXK（滬）2013-0018，飼養于中美冠科生物技術有限公司動物實驗室，使用許可證：SYXK（蘇）2014-0047，溫度（22±1）℃、相對濕度（60±5）%，自由攝食飲水。

1.2 儀器 680 酶聯免疫檢測儀（上海眾生聲明科學發展有限公司）；BSA124S 電子分析天平［塞多利斯科儀器（北京）有限公司］；D3024R 微量高速冷凍離心機（美國Scilogex 公司）；ELX808 酶標儀（美國 BioTek 公司）；Basic164-5050 電泳電源、TY10165-8001 垂直電泳槽、GelDoc凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司）；YD-1508A 石蠟切片機（金華市益迪醫療設備廠）；Axioplan 2 imaging 光學顯微鏡（德國Carl Zeiss Jena 公司）。

1.3 試藥 參附注射液［華潤三九（雅安）藥業有限公司，批號17040205004］；左旋多巴片（浙江遠力健藥業有限責任公司，批號 170701）；1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP，東京化成工業株式會社，批號 JBVHJCB）；小鼠酪氨酸羥化酶（TH）ELSIA 檢測試劑盒（武漢伊艾博科技有限公司，批號2620187320）；Rabbit tyrosine hydroxylase 抗體［愛必信（上海）生物科技有限公司，批號 34i7370］；Rabbit GAPDH 抗體（美國 Bioworld 公司，批號 AA0101）；goat anti Rabbit IGg（美國 Bioworld 公司，批號CJ4422）；DAB顯色試劑盒（碧云天生物技術有限公司，批號033016160503）。

2 方法

2.1 分組、給藥、造模 30 只雄性小鼠，隨機分為 5 組，每組6 只，分別為對照組（腹腔注射生理鹽水）、模型組（腹腔注射 25 mg／kgMPTP）、參附注射液組（腹腔注射8 mg／kg）、左旋多巴組（灌胃 25 mg／kg）、參附注射液＋左旋多巴組（腹腔注射 8 mg／kg＋灌胃 25 mg／kg）。除對照組外，其余各組小鼠腹腔注射25 mg／kg MPTP 7 d 以建立帕金森病模型，給藥14 d 后進行實驗。

2.2 小鼠行為學檢測

2.2.1 爬桿實驗 選擇50 cm 長、1 cm 粗的木桿作為爬桿，頂端固定直徑2 cm 的泡沫塑料小球，爬桿上纏繞醫用膠布以防止打滑。實驗前1 周，每天進行1 次爬桿訓練，最后1 次給藥后進行檢測，將小鼠放至球頂使其爬下，以小鼠雙前肢接觸桿底平臺為完成爬桿，記錄爬完所需的時間。每只小鼠爬桿5 次，取平均值。

2.2.2 懸掛實驗 實驗前1 周，每天將小鼠2 只前爪懸掛于水平線上停留10 s，給藥結束后進行檢測。如小鼠在10 s內用 2 只后爪抓住線，記 3 分；1 只后爪抓住線，記 2 分；2 只后爪均抓不住線，記 1 分；小鼠跌落，記 0 分。

2.3 血清及腦組織TH 水平檢測 小鼠行為學實驗后頸動脈取血，脫頸處死，冰上取出黑質區新鮮腦組織置于凍存管中，液氮速凍后，放入-80 ℃冰箱中保存。ELISA 試劑盒檢測血清及黑質區腦組織TH 水平，具體操作方法參考說明書。

2.4 組織切片及染色 小鼠行為學實驗后頸動脈取血，脫頸處死，冰上取出大腦，迅速放入多聚甲醛溶液中固定，制備蠟塊，切片后脫蠟復水，HE 染色，脫水后封片，光鏡觀察。再免疫組化染色，切片復水后，3% H2O2中滅活組織切片中的內源性過氧化物酶，清洗后進行抗原修復，山羊血清滴封閉，一抗4 ℃下過夜，二抗37 ℃下孵育1 h，滴加DAB顯色液染色，蘇木素復染，脫水后封片，光鏡觀察。通過Image pro plus 軟件統計各圖片中蛋白陽性表達的平均光密度值，導出數據，Excel 軟件處理，SPSS 軟件進行統計。

2.5 大腦黑質組織TH 蛋白水平檢測 采用Western blot法。精密稱取小鼠腦組織，裂解，BCA 法檢測蛋白濃度，根據目的蛋白的分子量制備合適濃度的SDS-PAGE 凝膠，加樣后通電，進行垂直電泳，蛋白被適當分離后停止，冰浴，濕法轉膜，封閉 1 h 以上，加入稀釋好的一抗，4 ℃擺搖床上緩慢搖動孵育過夜，加入稀釋好的二抗，室溫下孵育2 h，洗滌3 次，采用凝膠成像系統軟件進行化學發光成像，拍照并保存。

2.6 統計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理，數據以（）表示，組內或組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 具有統計學意義。

3 結果

3.1 參附注射液對小鼠行為學的影響 表1顯示，與對照組比較，模型組小鼠爬桿時間顯著延長（P＜0.01），懸掛實驗得分顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠爬桿時間顯著縮短（P＜0.05，P＜0.01），懸掛實驗得分顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 參附注射液對小鼠行為學的影響（， n=6）

表1 參附注射液對小鼠行為學的影響（， n=6）

注：與對照組比較，## P＜0.01；與模型組比較，? P＜0.05，??P＜0.01

組別 爬桿時間／s 懸掛實驗得分／分對照組 7.8±1.3 2.5±0.3模型組 15.7±1.4## 0.8±0.5##參附注射液組 11.1±1.3? 1.8±0.6??左旋多巴組 10.8±1.6? 1.9±0.7??參附注射液＋左旋多巴組 9.7±1.9?? 2.0±0.8??

3.2 參附注射液對小鼠黑質神經元的影響 圖1顯示，對照組小鼠黑質致密度神經元數量豐富，胞體較大，多為橢圓形，胞漿染色較淡，細胞核染清晰；模型組小鼠部分神經元胞體深染，膠質細胞增生，神經元數目減少；參附注射液組、左旋多巴組視野內小鼠黑質正常神經元平均數量均明顯高于模型組，形態上可觀察到2 組黑質殘存的神經元較多，細長、胞體深染的神經元數量較少，膠質細胞增生得到改善；參附注射液＋左旋多巴組小鼠黑質正常神經元數目僅次于對照組，少部分黑質細胞黑色素減少，少部分神經元胞體深染，胞核濃染。

圖1 各組小鼠黑質HE 染色

3.3 參附注射液對TH 水平的影響 表2顯示，與對照組比較，模型組TH 水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，給藥組其水平顯著升高（P＜0.01）。

表2 參附注射液對TH 水平的影響（， n=6）

表2 參附注射液對TH 水平的影響（， n=6）

注：與對照組比較，## P＜0.01；與模型組比較，? P＜0.05，??P＜0.01

組別 血清 TH／（pg·mL-1）黑質 TH／（ng·g-1）對照組 1 443.5±137.6 3.012±0.268模型組 621.0±78.4## 1.359±0.144##參附注射液組 912.8±103.1? 2.217±0.192??左旋多巴組 986.4±96.9? 2.109±0.255??參附注射液＋左旋多巴組 1 145.5±112.3?? 2.538±0.245??

3.4 參附注射液對TH 蛋白表達的影響 圖2顯示，與對照組比較，模型組小鼠大腦黑質區TH 蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，給藥組其蛋白表達顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

4 討論

流行病學調查表明，在60 歲以上人群中帕金森病患病率為1%，并且每年新增患者 10 萬以上［9］，既往臨床研究表明，左旋多巴制劑可引起周圍性、中樞性2 類不良反應［10］，故減少及延遲其不良反應發生，改善其對腦中黑質多巴胺能神經元的毒性作用，是臨床關注熱點。帕金森病主要病理基礎是黑質多巴胺能神經元進行性死亡，造成TH表達和數量下降，最終導致合成減少黑質-紋狀體多巴胺濃度不足，引起運動癥狀［11］，目前還沒有針對多巴胺能神經損傷的保護藥物。

圖2 參附注射液對TH 蛋白表達的影響

中醫認為，帕金森病屬于 “顫證”“痹癥”范疇，因為邪風、邪熱、邪濕阻滯經絡，加之老年人氣血不足，難以溫養筋脈；病久入絡，瘀血內阻，血行不暢，導致肢體震顫、痙攣、麻痹等癥狀，主病在肝，病久涉及脾胃，其病位在腦髓、筋脈，表明該疾病發生不僅與肝之疏泄失常、脾虛失運有聯系，也與老年人氣血兩虛密切相關［12］。中藥具有安全性高的優勢，在帕金森病臨床治療中受到越來越多的重視，如銀杏平顫方、肉蓯蓉等［13-14］；參附注射液含有人參和附片。臨床研究顯示其對神經、心血管、免疫系統功能具有不同程度的保護作用［8，15］，其中人參皂苷是人參主要活性成分，參附注射液中其含有量＞0.8 mg／mL，可通過激活神經細胞存活機制和神經保護機制，從而發揮促進神經發育、調控神經遞質、改善學習與記憶能力的作用［16］，還有抗疲勞、增強心肌功能，能保護自身免疫系統，促進物質代謝和抗氧化，同時可提高機體適應性，有升壓、穩壓等作用［17］；附片所含烏頭堿可興奮迷走神經加快心率，有明顯升血壓的作用，對陽虛、痹癥有效。

本實驗應用MPTP 致小鼠帕金森模型，研究參附注射液單獨應用及聯合左旋多巴時對帕金森病小鼠的治療作用。結果顯示，參附注射液可明顯縮短小鼠爬桿時間，提高小鼠懸掛實驗得分；參附注射液、左旋多巴及兩者聯用時均對小鼠有神經保護作用，并且能明顯提高血清、大腦黑質區TH 水平及黑質區TH 蛋白表達，以聯合應用更強，表明參附注射液對帕金森病小鼠有較好的治療效果，而且聯合左旋多巴時作用更強。