扶正救肺方提取工藝的優(yōu)化

沈丹丹，顧志榮，馬天翔，許愛霞，祁 梅，劉潔麗，葛 斌

［1.甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，甘肅 蘭州730000；2.甘肅省人民醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省中藥質量與標準研究重點實驗室 （培育基地），甘肅 蘭州 730000］

特發(fā)性纖維化是彌漫性間質性肺病中的1種特殊類型，是1種不可逆纖維化、原因不明、發(fā)生于成人、局限于肺及進行性致纖維化的間質性肺炎［1］，其發(fā)病原因及分子機制目前仍不清楚，目前尚無確切的治療手段［2］。該病死亡率高、預后差，明確診斷后中位生存期僅有 2～3年，5年生存率不足40%。中醫(yī)認為特發(fā)性纖維化屬 “肺痹”“肺痿”等范疇，屬本虛標實之證，其病機在于機體氣虛血瘀、痰瘀互阻、痰熱蘊肺。

扶正救肺方主要藥物構成為黃芪、炒白術、沙參、生地、麥冬、丹參、川芎、當歸等 14 味，是甘肅省人民醫(yī)院在中醫(yī)理論指導下，以益氣、健脾、活血為基本治法，結合臨床實踐擬定的治療特發(fā)性纖維化的中藥湯劑，目前已在臨床應用十余年，并取得了較好的臨床療效，深受患者認可。研究表明，該方君藥黃芪作用明確、安全可靠，據(jù)報道其主要有效成分黃芪甲苷及其皂苷元環(huán)黃芪醇、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪總皂苷等均有治療特發(fā)性纖維化的作用［3-4］。川芎、當歸作為本方的主要藥物，其共有的主要有效成分阿魏酸能夠降低肺過敏、炎癥及黏液產生，有治療特發(fā)性纖維化的潛在作用［5］。本研究以黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸得率及干浸膏提取率為指標，通過多指標加權綜合評分考察加水倍量、提取次數(shù)及提取時間對扶正救肺方提取效果的影響，優(yōu)選最佳提取工藝，為扶正救肺顆粒的開發(fā)研究提供基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100 LC／DAD 系統(tǒng)（包括G1312A 二元梯度洗脫泵、G1313A 進樣器、G1315BDAD 檢測器、G1316A 柱溫箱和Agilent 化學工作站，美國 Agilent 公司）；ELSD-UM 3000 蒸發(fā)光散射檢測器、十萬分之一 Sartorius BT125D 精密電子天平（德國 Sartorius 公司）；SK 3300H 超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；DK-98-11A 電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；L-500 型臺式低速離心機（湘儀離心機儀器有限公司）。

1.2 試藥 黃芪、當歸、川芎、白術等14 味中藥飲片購于甘肅隴脈藥材有限公司，均經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室李碩副教授鑒定符合2015年版 《中國藥典》 一部有關規(guī)定。對照品黃芪甲苷（批號110781-201616）、阿魏酸（批號 110773-201313）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號111920-201606），均購自于中國食品藥品檢定研究院。色譜純乙腈（上海星可高純溶劑有限公司，批號011360403）；色譜純甲醇（天津北辰方正試劑廠，批號20170210）；色譜純甲酸（天津大茂化學試劑廠，批號20161011）；分析純甲醇（天津北辰方正試劑廠，批號20170717）；超純水。

2 方法與結果

2.1 阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含有量測定

2.1.1 供試品溶液制備 精密量取30 mL 提取液，置包有遮光紙的具塞錐形瓶中，加入甲醇溶液50 mL，密塞，稱定質量，超聲提?。üβ?90 W，頻率 59 kHz）60 min，放冷，稱定質量，甲醇補足減失質量，搖勻，3 000 r／min 離心5 min，取上清液，過濾，溶劑回收至干，以甲醇溶液充分溶解，定容至100 mL 量瓶中，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.1.2 混合對照品溶液制備 分別精密稱取阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，置于棕色量瓶中，加甲醇超聲使完全溶解，定容至刻度線，制成阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷質量濃度分別為0.025 2、0.0 158 mg／mL 的混合對照品溶液，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 色譜條件 反相 Agilent Eclipse Plus-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；乙腈（A）-0.2% 甲酸（B）為流動相，梯度洗脫（0～10 min，8%～13% A；10～20 min，13%～20% A；20～40 min，20%～40% A；40～60 min，40%～55% A；60～70 min，55%～85% A；70～90 min，85%～100%A）；體積流量 1.0 mL／min；檢測波長 260 nm（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）、320 nm（阿魏酸）；柱溫 30 ℃；進樣體積10 μL。在上述色譜條件下，精密吸取混合對照品溶液及供試品溶液進樣，結果表明2種成分的分離度均大于1.5，理論板數(shù)以阿魏酸峰計＞5 000。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.1.4 線性關系考察 分別精密量取 “2.1.2”項下混合對照品溶液 0.5、1、2、4、6、8、10 mL，置 10 mL 量瓶中，用甲醇逐級稀釋成每 1 mL 分別含有阿魏酸 1.26、2.52、5.04、10.08、15.12、20.16、25.20 μg，每 1 mL 分別含有毛蕊異黃酮葡萄糖苷 0.79、1.58、3.16、6.32、9.48、12.64、15.80 μg 的系列對照品溶液，分別吸取10 μL在 “2.1.3”項條件下進樣。以混合對照品質量濃度為橫坐標（X），相應的峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷方程分別為Y=58.954 7X＋10.422 3（r= 0.999 7）、Y= 36.8172X- 2.9726（r=0.9997），分別在 1.26～25.20、0.79～5.80 μg／mL范圍內線性關系良好。

2.1.5 精密度、穩(wěn)定性試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，在 “2.1.3”項色譜條件下連續(xù)進樣 6 次，考察日內精密度，結果阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積RSD分別為 1.67%、1.56%。再精密吸取混合對照品溶液10 μL，在 “2.1.3”項色譜條件下每天進樣 3 次，連續(xù)測定3 d，考察日間精密度，結果阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積RSD 分別為2.21%、1.48%，表明該儀器精密度良好，對照品溶液3 d 內穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復性試驗 按 “2.1.1”項下方法平行制備供試品溶液 6 份，分別精密吸取 10 μL，在 “2.1.3”項色譜條件下進樣，測得阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含有量的RSD（n=6）分別為 2.76%、1.96%，表明該方法重復性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗 分別精密吸取已測定的供試品溶液共 9 份，每 3 份為一組，按低、中、高 3 個水平精密加入混合對照品溶液適量，按 “2.1.1”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1.3”項色譜條件下進樣，測得阿魏酸平均加樣回收率103.56%，RSD 3.23%；毛蕊異黃酮葡萄糖苷平均加樣回收率102.43%，RSD 2.34%。

2.1.8 樣品含有量測定 按 “2.1.1”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1.3”項色譜條件下進樣，以外標法計算含有量，結果見表2。

2.2 黃芪甲苷含有量測定

2.2.1 供試品溶液制備 本研究引用 《香港中藥材標準》黃芪藥材中黃芪甲苷的含有量測定方法制備供試品溶液［6-7］。精密量取提取液 30 mL，減壓干燥 72 h，將浸膏粉置 50 mL 離心管中，加甲醇 30 mL，超聲處理 30 min（功率 90 W、頻率 59 kHz），3 000 r／min 離心 5 min，取上清液，離心所得殘渣用甲醇洗滌 2 次，每次 15 mL，再超聲處理 5 min（功率 90 W、頻率59 kHz），3 000 r／min 離心5 min，過濾，合并 3 次濾液，用旋轉蒸發(fā)儀減壓蒸干，殘渣用10%氨水溶液10 mL 重新溶解，放置10 min，不時振搖，將溶液移至分液漏斗中，用水飽和正丁醇溶液萃取3次（15、10、10 mL），合并萃取液，以旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。進樣前，用 0.45 μm 微孔濾膜過濾。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取黃芪甲苷對照品0.5 mg置于5 mL 量瓶中，如有未溶小顆粒可超聲至完全溶解，加甲醇至刻度線，得到每1 mL 含黃芪甲苷0.1 mg 的對照品溶液。

2.2.3 色譜條件 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈-水；體積流量0.8 mL／min；柱溫 25 ℃；進樣量 20 μL。蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）參數(shù)為漂移管溫度40 ℃；霧化溫度為40 ℃；氮氣體積流量 1.5 L／min；增益為2。色譜圖見圖2。

圖2 各樣品HPLC-ELSD 色譜圖

2.2.4 線性關系考察 精密吸取黃芪甲苷對照品貯備液，分別稀釋成每 1 mL 含黃芪甲苷 7.5、25、37.5、50、100 μg，0.45 μm 微孔濾膜過濾，在 “2.2.3”項色譜條件下進樣，以黃芪甲苷對照品溶液質量濃度的常數(shù)對數(shù)為橫坐標（X），相應峰面積的常數(shù)對數(shù)值為縱坐標（Y）進行回歸，得方程為 lgY=1.711 8lgX＋7.442 0（r=0.999 8），在 7.5～100 μg／mL 范圍內線性關系良好。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取供試品溶液，在 “2.2.3”項色譜條件下重復進樣6 次。測得黃芪甲苷相對保留時間的RSD 為2.07%，峰面積RSD 為1.92%，表明該儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，在“2.2.3”項下色譜條件分別于 0、2、4、8、12、24 h 進樣，測得黃芪甲苷峰面積RSD 為2.04%，表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復性試驗 按 “2.2.1”項下方法平行制備供試品溶液6 份，在 “2.2.3”項色譜條件下進樣，測得黃芪甲苷含有量RSD 為2.34%，表明該方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 分別精密吸取已測定的提取液共9 份，每 3 份為一組，按低、中、高 3 個水平精密加入黃芪甲苷對照品溶液適量，按 “2.2.1”項下方法制備供試品溶液，在 “2.2.3”項色譜條件下測定峰面積，測得黃芪甲苷的平均回收率為102.25%，RSD 2.84%。

2.2.9 樣品含有量測定 按 “2.2.1”項下方法制備供試品溶液，在 “2.2.3”項色譜條件下測定峰面積，以外標法計算含有量，結果見表2。

2.3 干浸膏提取率測定 精密吸取提取液5 mL，置已干燥至恒定質量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，減壓干燥至恒定質量，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質量，計算干浸膏提取率，結果見表2。

2.4 多指標加權正交試驗法優(yōu)選提取工藝

2.4.1 水提工藝優(yōu)選 在預試驗基礎上，選取藥材加水量（A）、提取次數(shù)（B）、提取時間（C）等 3 個影響提取的主要因素，采用多指標加權正交試驗法［8］，以 L9（34）正交表安排實驗，以阿魏酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷得率以及干浸膏提取率的綜合評分為指標，優(yōu)選提取工藝。因素水平見表1。

表1 因素水平

2.4.2 正交試驗設計 按處方比例稱取黃芪、當歸等14味藥材，置5 000 mL 圓底燒瓶中，按照正交試驗表安排試驗進行提取，將提取液適當濃縮，以純凈水定容到250 mL量瓶中。將黃芪甲苷（X1）、阿魏酸（X2）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（X3）得率以及干浸膏提取率（X4）進行綜合評分，評分時以各指標的最大值為參照，將數(shù)據(jù)進行歸一化后設定不同權重，其中X1分值權重系數(shù)為0.25，X2分值權重系數(shù)為0.3，X3分值權重系數(shù)為0.25，X4分值權重系數(shù)為 0.2，得到綜合指標。綜合評分Y=X1／X1max×0.25＋X2／X2max×0.3＋X3／X3max×0.25＋X4／X4max×0.2。結果見表2，方差分析見表3。

表2 試驗設計及結果

表3 方差分析

表2 可知，因素 A 中各水平影響大小順序為 A3＞A2＞A1，因素 B 中各水平影響大小順序為 B2＞B1＞B3，因素 C中各水平影響大小順序為C3＞C2＞C1，各因素對提取工藝影響大小為 A＞B＞C，最佳提取條件為 A3B2C3；表3 表明，A、B、C 各因素對扶正救肺方提取工藝均有顯著影響。綜合考慮，最終提取工藝為加10 倍量的水提取3 次，每次1.5 h。

2.5 驗證試驗 以上述優(yōu)化條件，平行3 次驗證試驗，見表4。黃芪甲苷得率、阿魏酸得率、毛蕊異黃酮得率、干浸膏提取率的平均值分別為 12.31 μg／g、99.51 μg／g、39.69 μg／g、55.43%，RSD 分 別 為 2.16%、0.79%、2.28%、1.38%，表明該工藝穩(wěn)定可行，重復性良好，可用于提取。

表4 驗證試驗結果

3 討論

本研究在不改變原處方傳統(tǒng)提取方式（水煎）的基礎上對其進行工藝篩選。在考察指標的選取方面，既選擇作用明確、安全可靠的黃芪主要有效成分黃芪甲苷及主要藥物川芎、當歸共有的有效成分阿魏酸，又選取該方干浸膏提取率作為宏觀、全面的考察指標，以體現(xiàn)中藥復方多組分、多靶點的作用特點。

《香港中藥材標準》 中對黃芪甲苷的測定方法，主要在于改進了2015年版 《中國藥典》 中黃芪甲苷的提取方法及富集方法。以甲醇超聲提取替代索氏提取；以氨試劑溶解提取物后再以水飽和正丁醇萃取來除去酚、酸性成分并富集皂苷類成分，代替了大孔吸附樹脂富集純化的過程。比較可知，該方法通過對樣品處理進行2 方面的簡化，有效縮短了測定時間，同時避免了索氏提取及柱色譜富集純化給定量分析帶來的操作誤差。已有研究表明，2種方法測得的黃芪甲苷含有量結果沒有顯著性差異［7］。

查閱大量文獻發(fā)現(xiàn)，以HPLC-ELSD 法測定黃芪甲苷含有量，線性關系考察中對回歸方程的處理有并存的3種方法（直接以峰面積和進樣量進行線性回歸；以峰面積和進樣量的自然對數(shù)進行線性回歸；以峰面積和進樣量的常數(shù)對數(shù)進行線性回歸）。本研究對3種方法作了詳細考察，直接以峰面積和進樣量進行線性回歸所得回歸方程為Y=6×106X-91 671（r=0.981 1）；以峰面積和進樣量的自然對數(shù)進行線性回歸所得回歸方程為lnY=1.711 8lnX＋17.135 7（r=0.999 8）；以峰面積和進樣量的常數(shù)對數(shù)進行線性回歸所得回歸方程為 lgY=1.7118 lgX＋7.442 0（r=0.999 8）。結果表明，直接以峰面積和進樣量進行線性回歸所得的線性關系較差，而以自然對數(shù)和常數(shù)對數(shù)與進樣量進行線性回歸所得的回歸系數(shù)相同，本研究最終以峰面積和進樣量的常數(shù)對數(shù)進行線性回歸。

本研究分別采用了2種檢測器進行含有量測定。其中，二極管陣列檢測器適用于有共軛結構、有紫外吸收物質的檢測，具有靈敏度高、精密度好、線性范圍廣等優(yōu)點，其缺點是不適用于無紫外吸收的組分。本實驗中毛蕊異黃酮葡萄糖苷（260 nm）和阿魏酸（320 nm）均有紫外吸收，故選用二極管陣列檢測器。蒸發(fā)光散射檢測器靈敏度較低，適用于揮發(fā)性低于流動相的組分，特別適用于無紫外吸收或在紫外區(qū)有末端吸收的樣品檢測，黃芪甲苷在在紫外區(qū)只有末端吸收（200 nm），故選用蒸發(fā)光散射檢測器。

扶正救肺顆粒是由14 味中藥組成的復方，化學成分復雜，作用機制不明，為得到其穩(wěn)定可控的提取工藝，本研究采用多指標加權評分法進行工藝優(yōu)化，確定權重系數(shù)的方法一般分為2 類，即主觀權重系數(shù)和客觀權重系數(shù)，主觀權重系數(shù)又叫經(jīng)驗權重系數(shù)，是主研者對分析對象的各個因素，按其重要程度，依據(jù)經(jīng)驗主觀確定的系數(shù)，目前此類方法在中藥提取工藝綜合評價中多采用。通過查閱文獻，根據(jù)各成分的藥理作用與抗肺纖維化的相關性大小，以及在制劑中的含有量高低來確定各指標的權重比例。君藥黃芪中的黃芪甲苷［9-11］及黃芪黃酮［12］是抑制肺纖維化的主要有效成分，而毛蕊異黃酮葡萄糖苷是黃芪中的代表性黃酮成分，其權重均取0.25；當歸和川芎中都含有大量的阿魏酸，此成份在方中含有量相對較高，具有明確的抗肺纖維化作用［13-15］，故其權重取 0.3；干浸膏中含有多糖、黃酮、皂苷及其他水溶性成分，其抑制肺纖維化的程度相對較低且考慮成本問題，所以權重共取0.2。