基于HPLC-Q-TOF-MS技術鑒定不同品種花椰菜葉中硫代葡萄糖苷

彭 佩 田 艷 鄧放明 卿志星

(湖南農業大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128)

硫代葡萄糖苷(Glucosinolate，GS)是十字花科中重要的含硫次級代謝物，由β-D-硫代葡糖、磺酸肟和來源氨基酸的側鏈R組成。根據側鏈R的不同，硫代葡萄糖苷可分為脂肪族硫代葡萄糖苷，芳香族硫代葡萄糖苷和吲哚族硫代葡萄糖苷[1-2]。硫代葡萄糖苷的相關研究已超過150年[3]，已報道了120多種硫代葡萄糖苷[4]。硫代葡萄糖苷及其代謝產物具有顯著的抗癌活性，如異硫氰酸脂具有防癌抗癌效果，尤其是對膀胱癌、結腸癌和肺癌[5]。十字花科蔬菜花椰菜含有豐富的硫代葡萄糖苷，而在以前的研究中，十字花科植株中硫代葡萄糖苷的定性定量分析主要采用高效液相色譜(HPLC)法，但HPLC法需要更多的硫代葡萄糖苷標準品，且其專一性相對于高效液相色譜串聯質譜法(HPLC-MS)較差[6]。花椰菜食用部分主要是由花蕾、花枝、花軸等聚合而成的花球，而大量未被利用的莖葉含有硫代葡萄糖苷，但其所含硫代葡萄糖苷種類以及分布情況均尚未見報道。本研究擬采用HPLC-Q-TOF/MS技術研究硫代葡萄糖苷標準品質譜裂解規律，并在質譜裂解規律的基礎上對不同品種花椰菜葉中的硫代葡萄糖苷進行鑒定，為闡明花椰菜葉片中硫代葡萄糖的種類及其資源的綜合利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試花椰菜：品種包括寶塔花椰菜、青花菜和紫色花椰菜，均采自長沙市蔬菜研究所安沙實驗基地。將新鮮葉片清洗后放入65 ℃隧道式烘干箱內烘3 d，待葉片徹底干燥后，放入高速中藥粉碎機中粉碎，保存，備用。

無水乙醇：分析純，上海沃凱生物技術有限公司；

乙腈：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

甲酸：色譜純，天津市光復精細化工研究所；

二丙烯基硫代葡萄糖苷標準品：HPLC≥98%，美國Sigma公司；

4-(甲基亞磺酰)丁基硫代葡萄糖苷標準品：HPLC≥98%，成都曼思特生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜—四極桿飛行時間質譜聯用儀：1290-6530型，美國Agilent公司；

電熱鼓風干燥箱：101-2AB型，天津市泰斯特儀器有限公司；

恒溫水浴鍋：DZKW-S-4型，北京市永光明醫療儀器廠；

高速中藥粉碎機：ZN-400A型，長沙市岳麓區中南制藥機械廠；

隧道式烘干機：HSW-5型，安徽省臨泉縣食品機械廠；

溫度控制器：KSJD4-12型，上海電機公司實驗電爐廠；

臺式低速離心機：TD5A型，湖南赫西儀器裝備有限公司；

萬分之一電子天平：CP214型，奧豪斯儀器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 硫代葡萄糖苷的提取 精密稱取2.0 g干燥樣品置于150 mL錐形瓶中，加入70%乙醇溶液50 mL，70 ℃ 恒溫水浴提取30 min后，4 000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm濾膜后備用。

1.3.2 高效液相色譜質譜條件

(1)色譜條件：色譜柱Phenomenex C18柱(2.1 mm×150 mm，5 μm)；流動相A相為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈；洗脫條件0～10 min，1%～3% B；10～15 min，3%～10% B；15～35 min，10%～25% B；35～60 min，25%～90% B；檢測波長210 nm；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。

(2)質譜條件：ESI離子源；負離子檢測模式；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速10 L/min；噴霧器壓力241.3 kPa；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流速12 L/min；毛細管電壓3 500 V；錐孔電壓1 000 V；掃描離子范圍m/z100.00～1 200.00；二級裂解電壓15～50 eV(不同硫代葡萄糖苷使用不同的裂解電壓)。

2 結果與分析

2.1 花椰菜葉片提取物的總離子流圖

通過HPLC-Q-TOF-MS技術獲得3種花椰菜葉片中硫代葡萄糖苷提取物的總離子流圖(圖1)，查閱資料總結已報道的120多種硫代葡萄糖苷類化合物的結構及精確分子量，并將其[M]-及[M-H]-與花椰菜葉中存在的所有物質精確分子量進行比對，對精確分子量的誤差值小于10-5的數據進行二級質譜分析并根據2種硫代葡萄糖苷標準品二級質譜裂解規律對其結構進行鑒定，最終鑒定出8種硫代葡萄糖苷(表1)，其具體鑒定依據及質譜裂解規律解析如下。

圖1 花椰菜葉片提取物總離子流圖Figure 1 Total ion chromatogram of extraction of Baota, Qinghua and Zise cauliflower leaves

2.2 硫代葡萄糖苷標準品質譜裂解規律

2.2.1 4-(甲基亞磺酰)丁基硫代葡萄糖苷質譜裂解規律

如圖2所示：① 4-(甲基亞磺酰)丁基硫代葡萄糖苷的側鏈失去1個甲基從而形成碎片峰m/z421.053 1；② 4-(甲基亞磺酰)丁基硫代葡萄糖苷側鏈的第4’號碳原子(C4’)的取代基失去后和相鄰碳原子上的氫(H-3')組成雙鍵，從而在C3’與C4’組成碳碳雙鍵，形成m/z372.052 6的碎片離子，該碎片離子繼續在碳硫鍵(S-C1')斷裂后失去硫代葡萄糖基團形成分子離子峰m/z178.025 5；③ 硫代葡萄糖苷的碳硫鍵(S-C1')斷裂后與硫酸根離子相接形成m/z290.991 5的碎片離子；④ 碎片離子m/z259.021 0 是硫代葡萄糖苷的葡萄糖分子上的取代基硫被替換成硫酸根而形成。

表1 花椰菜葉片中的硫代葡萄糖苷Table 1 The glucosinolate in Baota Broccoli leaves,Qinghuacai leaves and Zise Broccoli leaves

圖2 4-(甲基亞磺酰)丁基硫代葡萄糖苷質譜圖及其質譜裂解途徑Figure 2 MS chromatogram of 4-(methysulfinyl)butyl glucosinolate and MS fragmentation patterns

2.2.2 2-丙烯基硫代葡萄糖苷質譜裂解規律 如圖3所示：① 2-丙烯基硫代葡萄糖苷的硫與相鄰碳原子發生斷裂后形成m/z241.002 4，259.012 9，195.033 3，274.990 1的碎片離子[4,7-8]，葡萄糖的2號碳原子上的羥基易與硫酸根離子發生交換反應從而形成m/z241.002 4，274.990 1的碎片離子[9]；② 硫酸化的葡萄糖容易發生裂解反應從而生成m/z138.972 6的碎片離子；③ 碎片離子m/z101.027 0是2-丙烯基硫代葡萄糖苷失去1個葡萄糖和1分子磺酸鹽醛肟基團后再失去硫酸根離子后所形成的；④ 碎片離子m/z161.988 7是2-丙烯基硫代葡萄糖苷的碳硫鍵(S-C1')斷裂從而失去硫代葡萄糖基團與相鄰的氫(H-2')而形成。

2.3 花椰菜葉中硫代葡萄糖苷的結構鑒定

2.3.1 3-(甲基亞磺酰基)丙基硫代葡萄糖苷鑒定依據及質譜裂解途徑 在寶塔花椰菜葉與紫色花椰菜葉中(保留時間1.709 min)均存在此m/z422.022 4離子化精確分子量。化合物的二級質譜圖[圖4(a)]存在m/z259.008 0 的碎片離子，在硫代葡萄糖苷標準品裂解規律的基礎上說明此化合物的結構式中有硫代葡萄糖基團，二級質譜圖m/z358.025 8，116.016 9，96.959 7，74.990 5為硫代葡萄糖苷的特征離子[10-11]，此化合物的質荷比為m/z422.022 4(分子式為C11H20NO10S3)，而標準品4-(甲基亞磺酰)丁基硫代葡萄糖苷的質荷比為m/z436.041 1 (分子式為C12H22NO10S3)，說明此化合物的結構式中比標準品4-(甲基亞磺酰)丁基硫代葡萄糖苷少1個CH2基團。綜上所述，此化合物被初步推斷為3-(甲基亞磺酰基)丙基硫代葡萄糖苷，其質譜裂解如圖4(b)所示。

圖3 2-丙烯基硫代葡萄糖苷質譜圖及其質譜裂解途徑Figure 3 MS chromatogram of 2-propenyl and MS fragmentation patterns

圖4 3-(甲基亞磺酰)丙基硫代葡萄糖苷質譜圖及其質譜裂解方式Figure 4 MS chromatogram of 3-(methysulfinyl)propyl glucosinolate and MS fragmentation pathways

2.3.2 4-(甲基亞磺酰)丁基硫代葡萄糖苷鑒定依據及質譜裂解途徑 在寶塔花椰菜葉、青花菜葉與紫色花椰菜葉中(保留時間1.723 min)均存在此m/z436.038 7離子化精確分子量，從此化合物的二級質譜圖[圖5(a)]可知，其存在m/z421.016 6，372.040 4，290.971 0，259.010 7，178.017 0，96.959 7及74.990 7的碎片離子，通過與標準品4-(甲基亞磺酰)丁基硫代葡萄糖苷的保留時間以及二級質譜進行比對發現，其碎片離子的質荷比在誤差范圍內與標準品4-(甲基亞磺酰)丁基硫代葡萄糖苷碎片離子的質荷比一致。綜上所述，此化合物被確定為4-(甲基亞磺酰)丁基硫代葡萄糖苷，其二級裂解如圖5(b)所示。

2.3.3 3-丁烯基硫代葡萄糖苷質譜裂解規律解析鑒定依據及質譜裂解途徑 在青花菜葉中(保留時間1.737 min)存在m/z372.037 5離子化精確分子量，其二級質譜圖[圖6(a)]中有m/z258.999 1，96.960 2，74.990 9等特征離子，基于硫代葡萄糖苷標準品裂解規律說明此化合物的結構式中有硫代葡萄糖基團，此化合物被初步推斷為3-丁烯基硫代葡萄糖苷丙基硫代葡萄糖苷，其質譜裂解如圖6(b)所示。

圖5 4-(甲基亞磺酰)丁基硫代葡萄糖苷質譜圖及其質譜裂解方式Figure 5 MS chromatograms of 4-(methysulfinyl)butyl glucosinolate and MS fragmentation pathways

圖6 3-丁烯基硫代葡萄糖苷質譜圖及其質譜裂解方式Figure 6 MS chromatograms of 3-butenyl glucosinolate and MS fragmentation pathways

2.3.4 4-羥基芐基硫代葡萄糖苷鑒定依據及質譜裂解途徑 在寶塔花椰菜葉和紫色花椰菜葉中(保留時間1.750 min)存在m/z424.020 2離子化精確分子量，其二級質譜圖[圖7(a)]中有m/z116.013 1，96.959 0，74.990 6等特征離子。基于硫代葡萄糖苷的質譜裂解規律，該化合物被初步推斷為4-羥基芐基硫代葡萄糖苷，其二級質譜裂解圖7(b)所示。

圖7 4-羥基芐基硫代葡萄糖苷質譜圖及其質譜裂解方式Figure 7 MS chromatogram of 4-hydroxybenzyl glucosinolate and MS fragmentation pathways

2.3.5 1-羥基-吲哚-3-亞甲基硫代葡萄糖苷鑒定依據及質譜裂解途徑 在寶塔花椰菜葉、青花菜葉與紫色花椰菜葉中(保留時間1.994 min)均存在m/z463.046 1離子化精確分子量，化合物的二級質譜圖[圖8(a)]中有m/z195.031 3的碎片離子，基于硫代葡萄糖苷標準品裂解規律說明此化合物的結構式中存在硫代葡萄糖基團，m/z96.959 2，74.991 3為硫代葡萄糖苷的特征離子。綜上所述，此化合物被初步推斷為1-羥基-吲哚-3-亞甲基硫代葡萄糖苷，其質譜裂解規律如圖8(b)所示。

2.3.6 3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷鑒定依據及質譜裂解途徑 在青花菜葉和紫色花椰菜葉中(保留時間15.094 min)存在m/z447.050 1離子化精確分子量，其二級質譜圖[圖9(a)]中有m/z96.958 8，74.990 9等特征離子。根據硫代葡萄糖苷的質譜裂解規律，此化合物初步推斷為3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷，其質譜裂解如圖9(b)所示。

2.3.7 1-含氧甲基吲哚-3-亞甲基硫代葡萄糖苷鑒定依據及質譜裂解途徑 在青花菜葉和紫色花椰菜葉中(保留時間18.871 min)存在m/z477.063 1離子化精確分子量，化合物的二級質譜圖[圖10(a)]中有m/z259.011 1，195.028 9的碎片離子，基于硫代葡萄糖苷標準品裂解規律說明此化合物的結構式中存在硫代葡萄糖基團，m/z96.959 4，74.990 7為硫代葡萄糖苷的特征離子。綜上所述，此化合物被初步推斷為1-含氧甲基吲哚-3-亞甲基硫代葡萄糖苷，其二級質譜裂解如圖10(b)所示。

圖8 1-羥基-吲哚-3-亞甲基硫代葡萄糖苷質譜圖及其質譜裂解方式Figure 8 MS chromatogram of 1-hydroxyindol-3-ylmethyl glucosinolate and MS fragmentation pathways

圖9 3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷質譜圖及其質譜裂解方式Figure 9 MS chromatogram of 3-indolymethyl glucosinolate and MS fragmentation pathways

圖10 1-含氧甲基吲哚-3-亞甲基硫代葡萄糖苷質譜圖及其質譜裂解方式Figure 10 MS chromatogram of 1-methoxyindol-3-ylmethyl glucosinolate and MS fragmentation pathways

2.3.8 6-(甲基磺酰)己基硫代葡萄糖苷鑒定依據及質譜裂解途徑 在青花菜葉中(保留時間18.956 min)存在m/z479.066 1離子化精確分子量，其二級質譜圖[圖11(a)]中有m/z96.961 1，74.990 8等特征離子。根據硫代葡萄糖苷的質譜裂解規律，其被初步推斷為6-(甲基磺酰)己基硫代葡萄糖苷，其二級質譜裂解如圖11(b)所示。

圖11 6-(甲基磺酰)己基硫代葡萄糖苷質譜圖及其質譜裂解方式Figure 11 MS chromatogram of 6-(methylsulfonyl)hexyl glucosinolate and MS fragmentation pathways

3 結論

通過HPLC-Q-TOF/MS技術鑒定不同品種花椰菜中的硫代葡萄糖苷，結果表明寶塔花椰菜葉中含有4種硫代葡萄糖苷,分別是3-(甲基亞磺酰基)丙基硫代葡萄糖苷、4-(甲基亞磺酰)丁基硫代葡萄糖苷、4-羥基芐基硫代葡萄糖苷、1-羥基-吲哚-3-亞甲基硫代葡萄糖苷；青花菜葉中含有6種硫代葡萄糖苷，分別是4-(甲基亞磺酰)丁基硫代葡萄糖苷、3-丁烯基硫代葡萄糖苷、1-羥基-吲哚-3-亞甲基硫代葡萄糖苷、3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷、1-含氧甲基吲哚-3-亞甲基硫代葡萄糖苷、6-(甲基磺酰)己基硫代葡萄糖苷；紫色花椰菜葉中含有6種硫代葡萄糖苷，分別是3-(甲基亞磺酰基)丙基硫代葡萄糖苷、4-(甲基亞磺酰)丁基硫代葡萄糖苷、4-羥基芐基硫代葡萄糖苷、1-羥基-吲哚-3-亞甲基硫代葡萄糖苷、3-吲哚甲基硫代葡萄糖苷、1-含氧甲基吲哚-3-亞甲基硫代葡萄糖苷。

本研究未能檢測出更多的硫代葡萄糖苷，后續將進一步對花椰菜葉中其他未知硫代葡萄糖苷的挖掘以及結構鑒定的研究。